CIAPIN1和Fibulin-3在膀胱尿路上皮癌中的表达及其临床意义

马建锋，黎 玮，李守宾，张朝华，王海江，邵丽军，袁晓菲，沙 泉

(1.保定市第一医院泌尿外科，河北保定 071000，2.河北医科大第二医院泌尿外科，河北石家庄 050000，3.河北省人民医院泌尿外科，河北石家庄 050057)

膀胱癌(bladder cancer，BC)是泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁患者的生命与健康[1]。临床上超过90%的膀胱癌患者为尿路上皮癌，其分为非浸润性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer，MIBC)。MIBC患者预后极差，其5年生存率不足50%[2]。因此，寻找可以提示肿瘤发生发展的预示因子，并进行早期诊断及治疗成为降低膀胱癌死亡率的有效手段之一。凋亡抑制因子1(cytokine-induced apoptosis inhibitor 1，CIAPIN1)是一种新型的细胞凋亡抑制因子，可以对抗细胞凋亡[3]。研究表明，CIAPIN1可以抑制由多种刺激因素所导致的凋亡，并且促进细胞增殖从而在肿瘤进展中发挥重要作用[3-4]。Fibulin-3属于含表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)的纤维蛋白样细胞外基质蛋白(又称 EFEMP1)，是由人类EFEMP1基因编码的蛋白质[5]。研究表明，Fibulin-3在多种肿瘤表达中上调[6]，而最近研究报道，Fibulin-3可以促进肌层浸润性膀胱癌的进展[7]，预示着该基因在膀胱癌的发生发展中可能起着重要作用。本研究通过荧光定量PCR、Western blot实验及相关性分析，探讨CIAPIN1和Fibulin-3在膀胱癌组织中的表达及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 组织标本自2012年3月至2017年12月，收集河北省保定市第一医院泌尿外科住院患者临床手术取下的膀胱癌组织和同一患者的癌旁组织各98例。其中男性51例，女性47例；年龄中位数为65岁，≤65岁者47例，>65岁者51例；TNM分期Ta～T1期者(NMIBC)51例，T2～T4期者(MIBC)47例；肿瘤≤3 cm者45例，>3 cm者53例；组织学分级grade Ⅰ者48例，grade Ⅱ～Ⅲ者50例；64例无淋巴结转移，34例有淋巴结转移。所有配对癌旁组织标本均无肿瘤残留或合并其他膀胱疾病，以上样本均有完整临床资料。

1.2 RNA提取及实时定量PCR膀胱癌及癌旁组织(约100 mg)分别加入1 mL RNA裂解液经组织研磨管冰上裂解。培养的细胞经磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)冲洗后直接加入1 mL RNA裂解液，总RNA提取参照Total mRNA Extract kit (Omiga)操作手册，用Nano2000(Thermo Fisher)核酸定量仪检测RNA的纯度和浓度。按照Invitrogen公司用于qRT-PCR的M-MLV第一链合成系统操作说明，取5 μg总RNA建立20 μL使用随机引物逆转录体系合成cDNA。继之，使用Invitrogen公司的Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG with ROX试剂盒和ABI 7500 Fast Real-time PCR扩增仪进行荧光扩增，利用以下引物检测CIAPIN1和Fibulin-3的mRNA表达，CIAPIN1-F：5′ GAG CTG CTG GAT CCA GAA GAT TTG AAG 3′，CIAPIN1-R：5′ CAG GTA GCA GTT TCC ACA AGC TGAC 3′；Fibulin-3-F：5′ GCC AGT GCT GCT GCA GTC GCA GGC 3′，Fibulin-3-R：5′ GCT CTA CAG TTG TGC GTC CCT GCA GTG 3′；GAPDH-F：5′ GGG TGT GAA CCA TGA GAA GTA TGAC 3′，GAPDH-R:5′ GTG GTC ATG AGT CCT TCC ACG ATA CC 3′。PCR结果采用相对定量法比较Ct值，以GAPDH作的Ct值为内参，采用ΔCt(Ct目的-Ct内参)法进行相对定量分析，用2-ΔCt计算公式计算所得值作为目的RNA的相对表达量。

1.3 蛋白提取及Western blot分别取膀胱癌及癌旁组织(约100 mg)加入1 mL 蛋白裂解液和10 μL 100 mg/mL 的苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)蛋白酶抑制剂，冰上操作经研磨裂解。离心收集蛋白质上清液，用改良的Lowry法进行蛋白定量。取等量蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完毕，取出凝胶进行半干转膜。转膜完毕，取出聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，置于含5%脱脂奶粉的TTBS(10 mmol/L tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，0.05% tween-20)封闭液中，于室温封闭2 h后进行CIAPIN1 (proteintech，12638-1-AP)，Fibulin-3(sc-365224)一抗4 ℃过夜、次日二抗结合反应1 h。最后用化学发光法检测抗体结合区带，以β-actin为内参基因。

1.4 免疫双荧光检测蛋白表达膀胱癌及癌旁组织经石蜡包埋后切片5 μm厚，常规脱蜡至水，抗原修复后室温冷却，10%山羊血清封闭，滴加CIAPIN1 (proteintech，12638-1-AP)和Fibulin-3(sc-365224)1∶50比例稀释的一抗，4 ℃过夜，次日荧光二抗(兔红、鼠绿)室温孵育30 min，滴加DAPI染细胞核。抗荧光衰减封片剂避光封片，激光共聚焦显微镜观察、照相。

2 结 果

2.1 CIAPIN1和Fibulin-3 mRNA在膀胱癌及癌旁组织中的表达以同一患者的癌旁组织作为对照，GAPDH为内参，采用实时定量PCR技术检测CIAPIN1和Fibulin-3 mRNA的表达情况。与对照组相比，CIAPIN1和Fibulin-3 mRNA水平在膀胱癌组织中的表达显著增加(P<0.01，图1)。CIAPIN1在膀胱癌组织和癌旁组中的表达分别为4.223±0.986 和2.054±0.866 (P<0.05)；Fibulin-3 在膀胱癌组织和癌旁组中的表达率分别为5.284±1.586 和1.981± 0.937 (P<0.05)。

2.2 免疫印迹检测CIAPIN1和Fibulin-3在膀胱癌组织中的表达通过Western blot检测膀胱癌组织及对应的癌旁组织的蛋白表达情况，与癌旁组织相比，CIAPIN1和Fibulin-3的蛋白水平在膀胱癌组织中的表达显著上调，而其内参基因β-actin在癌组织和癌旁组织中表达均没有明显的变化(图2A)。我们将Western blot的结果进行灰度值扫描，并进行统计学分析，CIAPIN1和Fibulin-3的蛋白水平在膀胱癌组织中的表达显著增加(P<0.05，图2B)。

2.3 免疫荧光检测CIAPIN1和Fibulin-3在组织样本中的表达利用免疫荧光检测CIAPIN1和Fibulin-3的蛋白水平在临床样本组织中的表达，与癌旁组织相比，CIAPIN1和Fibulin-3的蛋白水平在膀胱癌组织中的表达显著上调，而且在CIAPIN1高表达的组织位置Fibulin-3的表达同样增加(图3)。

图1 实时定量PCR检测膀胱癌及癌旁组织中CIAPIN1和Fibulin-3的mRNA表达量

A：CIAPIN1的mRNA在膀胱癌及癌旁组织中的相对表达量；B：Fibulin-3的mRNA在膀胱癌及癌旁组织中的相对表达量；*与癌旁组织(P)比较，P<0.01。

图2 Western blot检测CIAPIN1和Fibulin-3在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达

A：免疫印迹显示CIAPIN1和Fibulin-3在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达；B：统计学分析CIAPIN1蛋白相对表达量；C：统计学分析Fibulin-3蛋白相对表达量；*与癌旁组织(P)比较，P<0.05。

图3 免疫荧光检测CIAPIN1和Fibulin-3在膀胱癌及癌旁组织中的表达

2.4 CIAPIN1和Fibulin-3的表达与膀胱癌临床病理特征的关系将98例膀胱癌患者的不同临床病理因素与相应的CIAPIN1和Fibulin-3 mRNA表达水平进行配对分析，发现CIAPIN1和Fibulin-3的表达在不同性别和年龄个体之间没有差异(P>0.05)，但与癌症的病理分级呈正相关(P<0.05)，在TNM临床分期中，T2及以上患者CIAPIN1和Fibulin-3的表达显示高于T2以下等级(P<0.05)。淋巴转移患者样本中CIAPIN1和Fibulin-3的表达同样高于非转移个体(P<0.05，表1)。

表1 膀胱癌中CAIPIN1和Fibulin-3表达与临床病理特征的关系 [例(%)]

CIAPIN1：凋亡抑制因子1。

2.5 CIAPIN1和Fibulin-3的转录水平在膀胱癌组织中呈正相关关系通过Graphpad prism 5软件对上述qRT-PCR检测到膀胱组织中CIAPIN1和Fibulin-3的表达数据进行分析，两者的Pearson’scorrelation相关性系数r=0.2577，而且在统计学上具有显著性差异(P=0.03)，CIAPIN1与Fibulin-3的mRNA表达在膀胱组织中存在线性相关关系(图4)。

图4 CAIPIN1和Fibulin-3在膀胱癌组织中表达的相关性

3 讨 论

膀胱癌位于全身恶性肿瘤发病率的第8位，在泌尿系统肿瘤中发生率最高。尽管我国膀胱癌的发病检出率较欧洲低，但随着人口平均寿命的逐年递增、医疗水平的提高，疾病的检出水平提升，加之环境污染对人体致病风险的日益加重等，我国膀胱癌的发病率呈逐年增加的趋势[8]。对于早期膀胱癌患者，治疗手段相对简单而且效果明显，但是对于大多数中晚期患者，治疗效果不佳。筛选膀胱癌的标志基因，有助于我们及早发现病情，而深入研究膀胱癌的发病机制，在基因水平寻找膀胱癌的发病基因，将为膀胱癌诊治提供重要的临床价值。

CIAPIN1位于人染色体16q13，包含8个外显子和7个内含子，由939 bp编码成312个氨基酸，分子量为16.5 ku。在大多数人类血液恶性肿瘤和实体瘤中都会发现CIAPIN1表达异常[9-10]。CIAPIN1表达的上调或下调，取决于不同的组织、器官或肿瘤[11]，因为这与不同的调控机制、不同的基因表达水平或层次有关，所以更值得我们对CIAPIN1在癌症发生发展过程中的机制进行研究。敲低CIAPIN1显著抑制K562细胞的胞外信号调节激酶5(extracellular-regulated kinase 5，ERK5)和核转录因子-kappa B(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信号途径[9]。此外，microRNA-143还可以通过抑制CIAPIN1逆转紫杉醇诱导的人乳腺癌细胞耐药性[12]。然而CIAPIN1在膀胱癌中的表达及其作用尚不清楚。从临床样本中我们首先检测CIAPIN1的表达，实时定量PCR显示，在膀胱癌组织中CIAPIN1的基因转录水平显著高于同一患者的癌旁组织(P<0.01)，Western blots同样检测到CIAPIN1蛋白质表达水平上调(P<0.05)，表明CIAPIN1的表达水平可能与膀胱癌临床病情的发展程度存在相关性。

Fibulin-3的蛋白质是EFEMP1基因的表达产物，其包含串联重复的EGF样序列，还包含C末端纤维蛋白型结构域。研究表明，Fibulin-3在恶性胶质瘤中上调，可能在肿瘤侵袭性中发挥作用[13]。Fibulin-3基因启动子中表观遗传改变的扩展预测了胰胆管导管内乳头状黏液性肿瘤的形成[14]。另一方面，有研究表明Fibulin-3通过ERK1/2活性调节基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinases 2，MMP2)和基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinases 9，MMP9)，抑制肝细胞癌的迁移[15]。miRNA-143的上调通过抑制细胞因子诱导的CIAPIN1逆转人乳腺癌细胞的耐药性[12]。最近有报道，Fibulin-3可以促进MIBC的进展[16]。从基因的转录水平和蛋白表达水平2个层次，我们均证实Fibulin-3在膀胱癌组织中表达上调，预示着该基因在膀胱癌的发生发展中可能起着重要作用，而检测Fibulin-3表达可以作为膀胱癌的发生发展提示因子。

WANG等[9]在白血病K562细胞中研究发现，敲低CIAPIN1能显著降低ERK5磷酸化和NF-κB活性。而Fibulin-3在肿瘤微环境中需要NF-κB活化的方式促进细胞的迁移和侵袭[17]。因此，我们猜测CIAPIN1和Fibulin-3之间的相关性是通过NF-κB来介导完成。总之，CAIPIN1和Fibulin-3在膀胱癌中表达均上调，联合检测可能增加膀胱癌诊断的准确率。CAIPIN1和Fibulin-3在肿瘤的发生过程中可能存在相互调控，然而确切的机制目前还不是很清楚，它们之间的关系尚需进一步研究。