黄金芽不同色泽叶片生理特性研究

范延艮，赵秀秀，王翰悦，田月月，向勤锃，张丽霞

黄金芽不同色泽叶片生理特性研究

范延艮，赵秀秀，王翰悦，田月月，向勤锃，张丽霞*

山东农业大学园艺科学与工程学院，山东 泰安 271018

为筛选用于黄金芽叶色黄化分子机理研究的适宜材料，采用双层遮荫（平均光强约10 klx）、单层遮荫（平均光强约40 klx）和不遮荫3种光照强度处理黄金芽春梢，获得嫩绿色（H1W）、浅黄稍带绿色（H4W）、明黄色（Hs）3种新梢，同时以福鼎大白绿色新梢（CKf）为对照，选择芽下第二叶为材料，通过测定H2O2、O2-含量和组织化学定位、抗氧化物酶活性、光合响应曲线、叶绿素荧光等叶片生理指标，观测叶绿体膜系统结构。结果表明，浅黄稍带绿叶片H4W的H2O2、O2-含量、值和叶绿体膜系统情况与嫩绿色叶片H1W相近，处于未受逆境胁迫的生理状态；同时浅黄叶片H4W与明黄叶片Hs具有相似的黄化叶光合生理特性，两者在、、光饱和点、光补偿点等叶绿素荧光参数和光合指标上差异不显著，光响应曲线特征相似。由于浅黄稍带绿叶片（H4W）所具有的上述生理特点，推测其是探究黄金芽茶树品种黄化分子机理必不可少的研究材料。

黄金芽；光氧化胁迫；光照强度；黄化材料

黄金芽属于光照敏感型叶色突变茶树品种，已有研究表明，黄金芽的叶色受光照强度调控，光照强度为11~15 klx的时候开始黄化，高于60 klx可能导致叶片灼伤，而适当的遮荫处理可使黄化叶片复绿[1]。目前，人们以黄金芽自然光下的黄化叶与遮荫复绿叶为材料，运用转录组、蛋白组、代谢组等现代分子生物学方法探究其黄化的分子机理，并取得了良好进展。但也出现了一些研究结果不一致的现象，如：Song等[2]对自然光与遮荫45%处理的黄金芽新梢芽下第三叶进行转录组测序，结果发现自然光下黄化叶的类胡萝卜素途径基因抑制表达；而Li等[3]对遮荫度45%、60%以及自然光下的黄金芽一芽二叶材料的研究结果表明：自然光下黄化叶的类胡萝卜素途径基因表达是上调的。Zhang等[4]通过对自然光与60%遮荫度处理的黄金芽一芽二叶进行代谢组分析发现，黄化叶片中的总类黄酮含量显著下降，低于遮荫复绿叶；而Li等[3]的研究结果则表明：自然光下的黄化叶片中总多酚类含量显著高于60%左右遮荫度的复绿叶片。上述迥异的研究结果可能与试验所取材料的生理状态不同有关。虽然上述研究材料黄化叶均来源于自然光处理，但不同地区、季节等诸多因素均会影响自然光照强度，从而导致黄化叶片生理状态的不同。

众所周知，植物在胁迫状态下，代谢水平和基因表达会发生巨大变化，如果不能正确区分胁迫与非胁迫状态的研究材料，则会对研究结果产生偏差。黄金芽作为一种光照敏感型黄化茶树品种，目前对于不同光强条件下叶片的生理状态尚未被关注。为了筛选用于黄金芽的黄化分子机理研究的试验材料，本研究以四年生黄金芽茶树为材料，设置不同光强处理，获得嫩绿、浅黄和明黄3种不同色泽的叶片，同时设置自然光下的福鼎大白芽下第二叶作为对照，通过测定活性氧、抗氧化酶、叶绿素荧光参数等生理生化指标，探究不同光强下黄金芽叶片的生理特性，并为阐明黄金芽受光调控叶色的机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2018年4月茶树第一轮新梢萌发后，以4年生黄金芽无性系茶树品种为试验材料，以双层6针遮荫网（平均光照强度约10 klx，编号H1W）、单层6针遮荫网（平均光照强度约40 klx，编号H4W）以及自然光（平均光照强度约90 klx，编号HS）处理黄金芽茶树7 d，获得不同叶色的新梢，其芽下第二叶的叶色分别为嫩绿（H1W）、浅黄稍带绿（H4W）、明黄（HS）。取上述不同叶色材料进行相关生理指标测定，每个指标测定3个样品，取平均值。同时，以福鼎大白茶树品种（非叶色突变体）不遮荫处理为参照样（CKf，深绿色），以便分析黄金芽这一叶色突变体的生理特性。不同光照强度下的叶片颜色见图1。

1.2 试验方法

1.2.1 过氧化氢含量测定及组织化学染色

过氧化氢（H2O2）含量按照南京建成生物工程研究所生产的过氧化氢试剂盒（货号：A064-1）说明书测定。

H2O2的组织化学染色参考文献[5]的方法，略有修改。取新鲜叶片（芽下第二叶）用蒸馏水洗净后，放入1 mg·mL-1DAB反应液中（pH=3.8，50 mmol·L-1Tris-HCl），抽真空使叶片完全浸没，28℃避光保存14 h，然后用90%乙醇70℃水浴进行脱色，直至叶片完全脱绿后进行拍照。

1.2.2 超氧阴离子含量测定及组织化学染色

超氧阴离子（O2-）产生速率的测定参照王爱国等[6]的羟胺氧化法。O2-组织化学染色参考Jabs等[7]的方法，略作修改。取芽下第二叶用蒸馏水洗净后，放入0.5 mg·mL-1NBT反应液中（pH=7.8，10 mmol·L-1磷酸钾缓冲液），抽真空使叶片完全浸没，将其在室温黑暗条件下放置1 h，然后用90%乙醇70℃水浴进行脱色，直至叶片完全脱绿后进行拍照。

1.2.3 抗氧化系统酶活性测定

用氮蓝四唑（NBT）还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性，以抑制光化还原50%为1个酶活性单位；用愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性；过氧化氢酶（CAT）活性的测定参照Chance等[8]的方法。

1.2.4 叶绿素荧光参数测定

将茶树芽下第二片叶片暗处理30 min，采用英国Hansatech公司生产的FMS-2型调制式叶绿素荧光仪测定暗适应下最大荧光（F）、可变荧光（F）和初始荧光（F），获得最大光化学效率（）、实际光化学效率（）、光化学淬灭系数（）和电子传递速率（）。

1.2.5 光响应曲线测定

用Ciras-3型光合仪（PP-Systems公司，美国）测定不同光照强度处理下叶片的光响应曲线，测定参数由仪器的可调光源、外置式CO2供气系统和温度监控装置控制，通过光合计算器4.1.1（http://www.pengli.org.cn）计算模拟光响应曲线。

1.2.6 叶绿体膜系统观测

叶绿体超微机构观测参照Li等[3]方法，芽下第二叶避开叶脉取1~2 mm2大小叶片，4℃下用2.5%（︰）戊二醛固定过夜，然后用1%（︰）OsO4固定2 h，之后用30%~100%的梯度乙醇对固定样品进行脱水，最后用树脂固定，在超薄切片机上切片，用碱性柠檬酸铅和醋酸铀酰染色，在1400Plus透射电镜（JEM，日本）中观察叶绿体超微结构。

1.3 数据处理

利用Excel 2016软件对数据进行统计分析，利用SPSS 19.0软件通过单因素方差分析（One-way ANOVA）中的Duncan检验进行显著性差异分析（=0.05），利用GraphPadPrism 5.0软件作图。

2 结果与讨论

2.1 不同色泽叶片的氧化还原状态

从黄金芽不同色泽叶片和对照叶片中O2-和H2O2含量测定结果可知（图2-A），叶片中H2O2含量依次为H1W＜H4W＜HS＜CKf，其中H1W与H4W、HS与CKf之间的差异不显著，但H1W、H4W与HS、CKf之间的含量差异却十分显著。由此，可根据叶片中H2O2含量的高低将4个样品分成以下两组：第Ⅰ组为低H2O2含量组，包括H1W和H4W；第Ⅱ组为高H2O2含量组，包括HS和CKf。不同样品叶片中O2-含量高低情况与H2O2相似，也依次为H1W＜H4W＜HS＜CKf，但各样品之间的O2-含量差异均达到显著水平，其中H4W、HS和CKf的O2-含量分别是H1W的1.17、2.28倍和2.83倍。同时，从图2-A可以看出，4个样品也可根据O2-含量分成差异显著的高、低两组，并与H2O2的分组情况一致。此外，O2-和H2O2的含量测定结果与叶片的组织定位结果完全一致（图2-B）。

对黄金芽不同色泽叶片和福鼎大白叶片中3种抗氧化酶活性的测定结果见表1。由表1可知，清除O2-的SOD活性依次为CKf>H1W>Hs>H4W，但CKf与H1W，H1W与Hs之间的酶活性不存在显著差异。分解H2O2的POD活性以叶片H4W最高，分解H2O2并同时释放O2的CAT活性以H1W最低，它们分别与其他3个样品的酶活性差异达到了显著水平。

2.2 不同色泽叶片的叶绿素荧光与光合参数

叶绿素荧光参数值常用于叶片光合生理状态的判定。目前普遍认为，当值在0.80~0.85时，绝大多数高等植物处于健康生理状态；当下降时，表明植物受到了胁迫[9]。从表2可知，叶片H1W和H4W的值相近，且均大于0.82，而叶片Hs和CKf的值分别为0.67、0.70。由此推断，黄金芽的嫩绿色叶片H1W、浅黄色稍带绿叶片H4W均未受到光抑制或其他逆境的胁迫，但黄金芽的明黄色叶片Hs和对照CKf均受到了光抑制或其他逆境的胁迫，如：O2-和H2O2含量过高导致的氧化胁迫。

注：H1W：双层6针遮荫网下的黄金芽嫩绿色叶片；H4W：单层6针遮荫网下的黄金芽浅黄色叶片；HS：自然光下的黄金芽明黄色叶片；CKf：自然光下的福鼎大白叶片，下同

注：A：H2O2与O2-含量；B：O2-和H2O2的组织化学定位

Fig. 2Oxidative and antioxidant status of leaves under different leaf colors

表1 不同色泽叶片的抗氧化酶活性

注：‘**’即<0.01。同列不同小写字母表示处理间差异显著（<0.05）

Note: ‘**’ means<0.01. Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among treatments at 0.05 level

叶绿素荧光参数、和分别反映了实际光化学效率、光化学淬灭和光合电子传递速率情况。从表2可知，黄金芽不同色泽叶片的、和均显著低于对照CKf，其中H1W的、仅约为对照CKf的1/2。此外，黄金芽两种黄化叶片H4W和Hs的、显著高于嫩绿叶片H1W，但H4W与Hs之间的差异不显著；以H4W最高，Hs最低，且3个样品之间差异显著。

通过对比黄金芽不同色泽叶片光合参数发现（图3，表3），最大净光合速率M、表观光量子效率AQE、暗呼吸速率DRR均呈现为H1W>H4W>Hs，与叶片黄化程度成反比；而光饱和点Lsp、光补偿点Lcp则为H1W＜H4W＜Hs，与叶片黄化程度呈正相关。除DRR和Lcp外，黄金芽叶片的光合参数M、AQE和Lsp值均低于福鼎大白CKf。各样品之间的胞间CO2浓度（Ci）、气孔导度（Gs）和叶温随光照强度变化的趋势相同，其中，Ci以H4W最大，Gs以Hs最大，叶温以CKf最高且显著高于黄金芽的3个样品（图3）。

表2 不同色泽叶片的叶绿素荧光参数测定

Table 2 Determination of chlorophyll fluorescence parameters of leaves with different colors

注：‘**’即<0.01。同列不同小写字母表示处理间差异显著（<0.05）

Note: ‘**’ means<0.01. Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among treatments at 0.05 level

注：A为净光合速率；B为胞间CO2浓度；C为气孔导度；D为叶温

2.3 不同色泽叶片的叶绿体膜系统生理状态

从图4可知，与对照CKf相比，黄金芽的叶绿体膜系统缺乏清晰的基粒片层结构，这是该品种叶绿体膜系统的显著特征。同时，不同叶色的叶绿体在类囊体结构上也存在较大差异。明黄叶片Hs的类囊体结构模糊，有囊泡；嫩绿色叶片H1W类囊体结构清晰；浅黄稍带绿叶片H4W的类囊体结构总体上与H1W较相似，但清晰度稍有下降。

3 讨论与结论

黄金芽作为一种光照敏感型黄化茶树品种，其叶片会随着环境光照强度由低到高依次呈现“深绿→绿→黄绿→黄→金黄→黄白”[10]等多种色泽。本研究采用3种光照强度（自然光和2种遮荫覆盖）处理黄金芽茶树，获得了嫩绿、浅黄稍带绿和明黄3种色泽的新梢，并选取芽下第二叶进行了氧化还原状态、抗氧化酶、叶绿素荧光、光合作用等生理指标的测定以及叶绿体膜系统观测，同时通过与自然光下福鼎大白芽下第二叶相关结果进行对比分析，得出以下结论：

（1）黄金芽不同色泽叶片生理状态不同。其中，嫩绿色叶片H1W与明黄色叶片Hs之间，除SOD、POD酶活性外，其余所测指标均差异显著。浅黄稍带绿色叶片H4W的生理指标值大都居于H1W和Hs之间，其中一些指标值会偏向H1W或Hs。如：H4W与H1W的O2-、H2O2含量均低，值相近（0.82、0.83），的值在植物受到胁迫时会显著下降[11]，前人研究同样发现55%遮荫度的黄金芽叶片与70%和85%遮荫度的黄金芽叶片值无显著差异，而与自然光下的叶片差异显著[9]。此外，本研究中H4w与H1w的叶绿体的膜系统也无显著差异，以上结果表明两者同处于无胁迫的生理状态；而H4w与Hs在、、光合响应曲线特征、光饱和点、光补偿点等指标上差异不显著，两者具有相似的光合生理特性。综上所述，黄金芽浅黄色叶片H4W既具有明黄色叶片Hs的黄化生理特征，同时又处于与H1W相似的无逆境胁迫生理状态，相较于前人对黄金芽黄化机理研究采用自然光下的黄化材料和遮荫后的复绿材料[2-4]，H4W能较好地体现黄金芽品种的生理特性，是探究黄金芽茶树品种黄化分子机理必不可少的研究材料。

表3 不同色泽叶片的光合参数比较

Table 3 Comparison of photosynthetic parameters of different colorleaves

注：M：最大净光合速率；AQE：表观光量子效率；DRR：暗呼吸速率；Lsp：光饱和点；Lcp：光补偿点

Note: M: Maximumnet photosynthetic rate. AQE: Apparent Quantum Efficiency. DRR: Dark respiration rate. Lsp: Light saturation point. Lcp: Light compensation point

图4 不同叶色状态下的叶绿体结构

（2）与福鼎大白对照品种相比，黄金芽茶树品种具有以下光合生理特点：①光饱和点Lsp低、光补偿点Lcp高，表现出对光强变化的敏感性。②和光合电子传递能力较弱，其实际光化学效率、光化学淬灭和光合电子传递速率显著低于福鼎大白；③光合作用较弱，最大净光合速率M、表观光量子效率AQE低于福鼎大白。④具有独特的叶绿体膜系统，其典型特征是缺乏清晰的基粒片层[3]。结合本研究叶片O2-和H2O2含量测定和组织定位分析、叶温、叶绿素荧光等测定结果以及有关主要存在部位的报导进行综合分析，推测黄金芽叶绿体基粒片层的缺失与氧化和叶温等逆境胁迫无关，而与或光合电子传递链密切相关。

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Study on Physiological Characteristics of Leaves with Different Colors of ‘Huangjinya’

FAN Yangen, ZHAO Xiuxiu, WANG Hanyue, TIAN Yueyue, XIANG Qinzeng, ZHANG Lixia*

Shandong Agricultural University, Tai'an 271017, China

In order to screen suitable materials for studying the molecular mechanism of ‘Huangjinya’, the spring shoots of ‘Huangjinya’ were treated with double shading (average light intensity of 10 klx), single shading (average light intensity of 40 klx) and non-shading. And three new shoots, light green (H1W), light yellow (H4W) and bright yellow (Hs), were obtained. At the same time, the second leaf under bud was selected as material with ‘Fudingdabai’ green shoot (CKf) as control. The content of hydrogen peroxide, oxygen-and histochemical localization, antioxidant enzyme activity, photosynthetic response curve, chlorophyll fluorescence and other physiological indicators of leaves were measured and the structure of chloroplast membrane system was observed. The results show that The H2O2, O2-contents,value and chloroplast membrane system of light yellow leaf H4Wwere similar to those of light green leaf H1W, which were in a stress-free state. At the same time, the photosynthetic and physiological characteristics of light yellow leaf H4Wand bright yellow leaf Hs were similar. There were no significant differences in chlorophyll fluorescence parameters and photosynthetic indexes such as,, light saturation point and light compensation point, and the characteristics of light response curve were similar. Because of the above physiological characteristics of light yellow leaf H4W, it could be used as the research material to explore the molecular mechanism of yellowing of golden bud tea varieties.

cv. Huangjinya, photooxidation stress, light-intensity, chlorotic material

S571.1；Q945

A

1000-369X(2019)05-530-07

2019-03-13

2019-05-01

山东“双一流”奖补资金（515563001）

范延艮，男，博士研究生，主要研究方向为茶树生理与生态，876562801@qq.com。*通信作者：zlx_sdau@163.com