茶树果胶乙酰酯酶家族成员的鉴定和生物信息学分析

刘艳丽，马林龙，曹丹，金孝芳，冯琳，龚自明

茶树果胶乙酰酯酶家族成员的鉴定和生物信息学分析

刘艳丽，马林龙，曹丹，金孝芳*，冯琳，龚自明

湖北省农业科学院果树茶叶研究所，湖北 武汉 430209

茶树是氟的超富集植物，叶片高氟含量与人体健康密切相关。果胶乙酰酯酶（PAE）可能通过调控果胶的去乙酰化作用参与茶树叶片对氟的富集和解毒，然而目前并无茶树PAEs的相关报道。本研究以茶树舒茶早基因组和三代测序数据为基础，利用生物信息学的方法开展了PAEs的鉴定及其特性、进化和定位分析。结果表明，在茶树中，PAE家族有12个蛋白，属于PAE5、PAE8、PAE9、PAE10、PAE12等5个成员，具有CLDG、PxYH、GGGWC、GS、NWN、rYCDG、GCSAG、NaAYDSWQ、HCQ等9个保守基序；在进化关系上，茶树PAEs与葡萄、可可亲缘关系较近；12个CsPAEs氨基酸大小为326~515，分子量为36.7~56.9 kDa，等电点为5.1~8.9；除CsPAE5、CsPAE5-1定位线粒体，CsPAE10-1可能定位胞质外，其他9个CsPAEs定位细胞壁；CsPAE5、CsPAE5-1、CsPAE12和CsPAE12-1为跨膜蛋白。此研究结果将为解析PAE在茶树叶片氟富集和解毒过程中的功能奠定基础。

茶树；果胶乙酰酯酶；鉴定；生物信息学分析

植物细胞壁通常由多糖（纤维素、半纤维素和果胶）和结构蛋白组成，其中果胶是主要组分[1]。果胶是一类富半乳糖醛酸（GalA，通过-1,4糖苷键连接）的多糖，主要由同聚半乳糖醛酸（HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖I（RG-I）、鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ（RG-Ⅱ）和木糖半乳糖醛酸聚糖（XGA）4个结构域组成[2-4]。据报道，HG和RG-I骨架上半乳糖醛酸C2或C3羟基常发生乙酰化修饰[5]。此外，也有报道RG-I中的鼠李糖及RG-Ⅱ侧链上的岩藻糖和槭汁酸C3位发生乙酰化修饰[6-7]。果胶乙酰化发生在果胶从高尔基体向细胞壁分泌的过程中，然后乙酰化的果胶结合进细胞壁[8-9]。果胶乙酰化改变了果胶组分的理化性质，影响了细胞的粘连进而影响了细胞壁的结构[10]。果胶乙酰化的程度受果胶乙酰酯酶（Pectin acetylesterase，PAE）的调控，PAE具有切割乙酰酯键对果胶进行去乙酰化的作用[9,11]。

研究表明，果胶甲基酯酶（Pectin methylesterase，PME）调控果胶去甲基化，使果胶中自由基团增多，进而使细胞壁具有吸附结合更多重金属离子的能力。PAE可能同PME一样，通过调控果胶乙酰基化使细胞壁具吸附结合更多重金属离子的能力[4]，从而参与植物细胞壁对重金属的富集和解毒。目前，已有文献报道PAE参与植物生长发育繁殖过程[9,11]、果实硬度变化[12]及植物防御生物和非生物胁迫[13-16]。Pogorelko等[14]研究发现过量表达构巢霉菌的转基因拟南芥和二穗短柄草对病原菌具有更高的抗性；杨志远等[15]发现拟南芥T-DNA插入突变体对大豆疫霉菌更为敏感。然而，PAE参与植物重金属富集和解毒的报道一直缺乏。最近，我们利用定量蛋白质组学策略探讨茶树叶片对氟胁迫的响应时发现PAE显著上调表达，表明其参与叶片氟富集和解毒过程[16]。

茶树[(L.) O. Kuntze]是氟的超富集植物，其叶片高氟含量与人体健康密切相关。鉴于PAE参与茶树叶片氟富集和解毒过程，解析茶树PAE将有助于对叶片氟富集和解毒机制的了解。在高等植物中，PAE属于CE13超家族成员，有10个左右PAE成员，具有保守的PAE结构域[5,17]。然而，截止目前尚无茶树PAE家族成员的相关报道。最近，云抗10号基因组[18]和舒茶早基因组[19]序列信息相继释放，使得PAE家族成员的鉴定、特性分析和功能研究更为容易和可靠。本研究采用生物信息学的方法开展了茶树PAEs的鉴定、特性、进化和亚细胞定位分析，以期为解析PAE在茶树叶片氟富集和解毒过程中的功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验原料：采取湖北省茶树资源圃中鄂茶1号一年生扦插苗一芽二叶，自来水冲洗擦干、液氮速冻后保存于–80℃备用。

数据库：舒茶早（var. sinensis cv ‘Shuchazao’）基因组数据库[19]和三代测序数据（安徽农业大学韦朝领老师提供）及鄂茶1号转录组数据库[20]。

试验药剂：植物多糖多酚RNA提取试剂盒、零背景pTOPO-Blunt平末端克隆试剂盒购置于北京艾德莱生物科技有限公司；RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒购置于美国Thermo Scientific；TOYOBO高保真酶KOD plus购置于日本东洋纺（上海）生物科技有限公司；胶回收试剂盒购置于杭州新景生物试剂开发有限公司；Taq酶购置于大连宝生物工程有限公司；引物合成、样品测序由武汉天一辉远生物科技有限公司完成；其他生化试剂均购置于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

茶树PAEs基本特性分析使用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam），保守结构域分析使用NCBI CDD工具（https://www. ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi）。多重序列比对使用CLUSTALW（https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw）。信号肽分析使用SignalP5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP）。亚细胞定位预测使用TargetP 1.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP）、WoLFPSORT（https://wolfpsort.hgc.jp）和Loctree3（https://rostlab.org/services/loctree3）。蛋白跨膜结构分析使用TMHMM Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）。核和过氧化物酶体定位分析分别使用cNLS Mapper（http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）和PTS1 predictor（http://mendel.imp.ac.at/pts1）。使用MEGA X软件采用NJ（Neighbor-Joining）法构建进化树。

1.2.2 RNA提取、cDNA逆转录及CsPAEs克隆

以鄂茶1号一芽二叶为材料，使用植物多糖多酚RNA提取试剂盒提取总RNA，使用RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒获得总cDNA。

以基因组中TEA020946、三代测序获得的Tea_472383及鄂茶1号转录组数据库中Unigene0148795序列为参照，根据重复部分拼接PAE9并以此为模板设计引物。前置和后置引物分别为：5'-ATGATGAATAGAAGAAAAATTGAGTT-3'和5'-TCAGCCTATCAAGTTATGGCA-3'。同时，以基因组中TEA033219及鄂茶1号转录组数据库中Unigene0147524序列为参照设计PAE12引物，前置和后置引物分别为5'-ATGAGGAAGCTGATGGG-3'和5'-TTATTTGAAAACCAGATTGT-3'。随后，使用TOYOBO高保真酶KOD plus克隆得到目的条带，继而使用胶回收试剂盒回收，零背景pTOPO-Blunt平末端克隆试剂盒连接、转化DH5α，最后通过菌落PCR和测序验证。试验均参照相应试验盒说明书操作。

2 结果与分析

2.1 茶树PAE家族成员的鉴定

使用PAE保守结构域（pfam03283），在舒茶早基因组和三代测序数据中检索到26个蛋白。为了排除重复，使用CLUSTALW对26个蛋白进行了多重序列比对。结果表明，Tea_42986与Tea_50692序列相似性100%，TEA022428与Tea_38789序列相似性100%。随后，为了进一步验证，使用NCBI conserved domain database对余下的24个蛋白进行了保守结构域分析。结果表明，24个蛋白都是PAE超家族蛋白，其中16个蛋白是PAE；16个PAE蛋白中，10个蛋白的结构域序列完整，5个蛋白的结构域C端序列缺失，1个蛋白的结构域N端序列缺失。蛋白结构域序列缺失可能是测序或拼接不完全造成的，因此后续分析排除结构域序列不完整的6个PAEs。综上，在舒茶早基因组和三代测序数据中筛选到10个可能的PAE蛋白。

为了区分10个茶树PAEs，使用CLUSTALW软件将其与12个拟南芥PAEs（AtPAE1-12）进行了多重序列比对。结果表明，2个蛋白包括TEA023839和Tea_32472同AtPAE5相似性最高，氨基酸同源性分别为49.7%和60.8%；4个蛋白包括TEA023165、TEA022428、Tea_23392和Tea_42986同AtPAE8相似性最高，同源性为64.2%~67.6%；Tea_47238同AtPAE9相似性最高，同源性为66.6%；2个蛋白包括TEA009391和 TEA002398与AtPAE10相似性最高，同源性分别为61.4%和57.7%；TEA033219同AtPAE12相似性最高，同源性为63.5%（表1）。由此可初步推测，茶树中可能存在5个PAE成员，分别是PAE5、PAE8、PAE9、PAE10和PAE12。

2.2 茶树PAEs保守基序分析

Philippe等[5]对72个植物PAEs分析发现，PAEs具有CLDG、PxYh、gGxwC、GS、Nwn、rYCDg、GCSxG、NxayDxwQ、HCQ等9个保守基序（图1-A）。其中，HCQ是最保守的基序，GCSxG和NxayDxwQ也是重要的保守基序。为了验证茶树PAEs保守基序，使用ClustalX2.1对10个PAEs和12个拟南芥PAEs进行了多重序列比对。结果表明，茶树中存在有CLDG、PxYH、GGGWC、GS、NWN、rYCDG、GCSAG、NaAYDSWQ、HCQ等9个保守基序（图1-B）。同时，我们也发现仅有6个蛋白包括Tea_32472（PAE5）、TEA022428（PAE8）、Tea_23392（PAE8）、Tea_42986（PAE8）、TEA002398（PAE10）和TEA009391（PAE10）具有全部保守基序；TEA023165（PAE8）和TEA023839（PAE5）缺少中间的保守基序NaAYDSWQ；TEA0332199（PAE12）缺少N端的保守基序CLDG和PxYH，而Tea_47238（PAE9）缺少C端的保守基序HCQ（图1-C）。蛋白保守基序的缺失尤其是N端和C端保守基序的缺失，可能源于基因的选择性剪切，也可能是测序或拼接不完全造成的。

2.3 茶树PAEs的克隆和命名

为了验证和进一步分析，我们以鄂茶1号叶片cDNA为模板，以拼接的和设计全长引物，采用PCR对和进行了扩增，扩增得到了符合预期大小的单一条带（图2-A）。回收条带后进行了测序，测序结果表明，和大小分别为1191 bp和1 251 bp，与预期大小完全一致，分别命名为和（表1）。随后，对ClCsPAE9和ClCsPAE12进行了保守基序分析，发现二者均具有CLDG、PxYH、GGGWC、GS、NWN、rYCDG、GCSAG、NaAYDSWQ和HCQ 9个保守基序（图1-C）。

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通过多重序列比对，我们发现TEA033219与ClCsPAE12相似性96.8%（图2-B），Tea_47238与ClCsPAE9相似性100%（图2-C），推测TEA033219是ClCsPAE12的亚型，Tea_47238是ClCsPAE9的亚型，是由基因可变剪切引起的。同样地，TEA023165与Tea_42986（PAE8）相似性96.7%，Tea_23392与Tea_42986（PAE8）相似性97.3%，推测TEA023165和Tea_23392均是Tea_42986的亚型，是基因不同可变剪切类型造成的。此外，TEA023839与Tea_32472（PAE5）相似性85.2%，TEA002398和TEA009391（PAE10）相似性81.0%，且二者局部序列完全相同，推测也是选择性剪切形成的不同蛋白。相关推测有待通过试验进一步验证。

注：A: 72个植物PAEs的保守基序，B、C：12个茶树PAEs保守基序

至于Tea_42986（PAE8）与TEA022428（PAE8）二者相似性为82.9%，是2个不同的PAEs。由于Tea_42986与AtPAE8相似性高于TEA022428与AtPAE8的相似性，因此将Tea_42986命名为CsPAE8，TEA022428命名为CsPAE8-like。

综上，我们在茶树中共鉴定了12个PAE蛋白包括CsPAE5（Tea_32472）及亚型CsPAE5-1（TEA023839）、CsPAE8（Tea_429862）及亚型CsPAE8-1（Tea_23392）和CsPAE8-2（TEA023165）、CsPAE8-like（TEA022428)、CsPAE9（ClCsPAE9）及亚型CsPAE9-1（Tea_47238）、CsPAE10（TEA002398）及亚型CsPAE10-1（TEA009391）和CsPAE12（ClCsPAE12）及亚型CsPAE12-1（TEA033219）（表1）。

2.4 茶树PAE进化树分析

为了了解茶树PAEs同其他植物的进化关系，使用MEGA X构建了69个植物PAEs的进化树。69个植物PAEs分别是：水稻（）7个、二穗短柄草（）6个、高梁（）6个、拟南芥（）12个、大豆（）7个、番茄（）7个、葡萄（）5个、杨树（）8个、可可（）6个和茶树（）5个。进化树表明（图3），69个植物PAEs被聚为了4组，一组包括6个PAEs，PAE1、PAE2、PAE3、PAE6、PAE10和PAE12；二组包括PAE7、PAE8和PAE11；三组包括PAE4和PAE5；第四组仅包括1个PAE9。5个茶树PAEs包括CsPAE5、CsPAE8、CsPAE9、CsPAE10和CsPAE12分别聚到了相应组，并且在距离上同可可、葡萄PAEs较近，同单子叶植物（水稻和二穗短柄草）PAEs较远。此外，同一亚组的单子叶植物PAEs明显地聚在了一起。

图2 CsPAE9和CsPAE12的克隆（A）及蛋白比对（B、C）

Fig. 2The cloning ofand(A), and protein blast (B, C)

注：M：线粒体；S：分泌蛋白；Ch：叶绿体；V：液泡；Cy：细胞质基质；Ex：胞外基质。“*”表示预测结果相同

Notes:M: Mitochondria. S: Secretory protein. Ch: Chloroplast. V: Vacuole. Cy: Cytoplasmic matrix. Ex: Extracellular matrix. “*” indicate same predicted results

2.5 茶树PAE蛋白基本特性分析和亚细胞定位分析

使用在线ProtParam 软件（https://web.expasy.org/protparam）对茶树PAEs进行了分析。12个CsPAEs氨基酸平均大小为395，变化范围为326~515；蛋白分子量和等电点分别为36.7~56.9 kDa和5.1~8.9（表1），与拟南芥的氨基酸平均大小413，变化范围326~451、蛋白分子量和等电点分别为39~49 kDa和5.7~9.4基本一致。

信号肽是新合成肽链中指导蛋白质跨膜转移的一段N端序列，一般由15~30个氨基酸组成，是新生蛋白分泌到胞外的信号。信号肽预测结果表明，12个CsPAEs中，除CsPAE5、CsPAE5-1和CsPAE10-1不具有N端信号肽外，其他9个CsPAEs具N端信号肽，大小为19~24个氨基酸，是分泌蛋白（表1）。令人疑惑地是，CsPAE10具N端信号肽，而CsPAE10-1不具有N信号肽。

亚细胞定位是某种蛋白在细胞内的具体存在部位，蛋白的亚细胞定位分析有助于蛋白功能的初步判断。我们使用TargetP、LOCtree 和Wolf软件对12个CsPAEs进行了亚细胞定位预测。结果发现，4个CsPAEs 3种预测结果相同，7个CsPAEs 2种预测结果相同，仅CsPAE10-1 3种预测结果均不同，推测CsPAE5、CsPAE5-1定位于线粒体，9个具N端信号肽的蛋白包括CsPAE8、CsPAE8-1、CsPAE8-2、CsPAE8-like、CsPAE9、CsPAE9-1、CsPAE10、CsPAE12及CsPAE12-1是分泌蛋白，定位于细胞壁。值的提及地是，CsPAE10-1使用TargetP未定位于线粒体、叶绿体、胞外且另外两种预测结果不同，无法预测定位。随后，使用核定位软件cNLS Mapper（http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）、过氧化物酶体定位信号PTS1预测器（http://mendel.imp.ac.at/pts1）、跨膜螺旋预测软件TMHMM Server （http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM）对CsPAE10-1进行了进一步分析，结果发现CsPAE10-1无跨膜螺旋、无核和过氧化物酶体定位信号，因此推测其为细胞质基质蛋白，结果尚需进一步验证。此外，跨膜预测结果表明，CsPAE5、CsPAE5-1、CsPAE12和CsPAE12-1具有1~2个跨膜螺旋，是跨膜蛋白，这与Philippe等[5]报道的拟南芥PAEs没有跨膜蛋白结果并不相符。

图3 10个植物的69个PAEs进化树

sFig. 3Phylogenetic tree of 69 PAEs from 10 plantspecies

3 讨论

果胶是植物细胞壁的重要组成成分之一，在其从高尔基体向胞外泌出的过程中常发生乙酰化修饰，其乙酰化的程度受切割乙酰酯键的PAE的调控[7-8,11]。研究发现，PAE在植物生长发育、果实硬度和胁迫防御中具有重要作用[9,12,15-16]。

PAE是一个多基因家族，具有保守的PAE结构域。使用PAE保守结构域，在茶树舒茶早基因组和三代数据中检索到24个蛋白。保守结构域分析发现，24个蛋白中仅有10个PAEs结构域序列完整，且10个中仅有6个源于基因组，表明基因组测序并不完全或序列注释并不完整。为了进一步分析，我们克隆了PAE9和PAE12 CDS全长。在茶树中鉴定了12个PAEs，这和水稻10个、拟南芥12个、番茄13个、葡萄7个、杨树14个、猕猴桃10个和可可14个PAEs的结果基本一致。经过与拟南芥PAEs序列比对，初步推测12个茶树PAEs属于5个PAEs（成员），分别是PAE5、PAE8、PAE9、PAE10和PAE12。12个CsPAEs序列比对发现，5个PAEs均存在不同的亚型，表明PAE基因发生了可变剪切事件。

蛋白保守基序分析发现，CsPAEs具有CLDG、PxYH、GGGWC、GS、NWN、rYCDG、GCSAG、NaAYDSWQ、HCQ等共9个保守基序，较之于72个植物PAEs的保守基序CLDG、PxYh、gGxwC、GS、Nwn、rYCDg、GCSxG、NxayDxwQ和HCQ更为保守[5]，表明了茶树PAEs的保守性及与其他植物的分化。69个植物PAEs的进化树分析发现，不同物种同源PAEs明显地聚在了一起，表明PAEs在不同物种间具有高度保守性；CsPAEs与同为木本植物的可可、葡萄进化距离较近，表明它们间亲缘关系较近。此外，亚组内的单子叶植物PAEs聚在一起并与双子叶植物PAEs明显地分离，揭示了单子叶植物和双子叶植物的分化。

12个CsPAEs亚细胞定位预测发现，除CsPAE10-1定位外，其他11个CsPAEs的定位与拟南芥同源PAEs定位一致[5]，再次表明PAEs在不同的物种间具有高度的保守性，并且可能具有相同的生理生化功能。CsPAE8及亚型、CsPAE8-1ike、CsPAE9及亚型、CsPAE10-2、CsPAE12及亚型定位于细胞壁，表明它们在细胞壁执行功能。通过序列比对，前期在茶树叶片中鉴定到的响应氟胁迫的PAE是PAE8-1ike。鉴于CsPAE8-1ike定位于细胞壁并在氟胁迫后表达上调，推测CsPAE8-1ike可能通过调控果胶去乙酰化作用参与茶树叶片细胞壁对氟富集和解毒。然而，具体功能的解析尚需进一步深入研究。

综上，本研究通过生物信息学的方法共鉴定了12个茶树PAEs，并对它们进行了命名、进化分析、基本特性分析和亚细胞定位分析，以期为探讨CsPAE在茶树叶片氟富集和解毒过程中的功能提供研究基础。

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Identification and Bioinformatic Analysis of Pectin Acetylesterases fromTea Plant

LIU Yanli, MA Linlong, CAO Dan, JIN Xiaofang*,FENG Lin, GONG Ziming

Institute of Fruit and Tea, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430209, China

Tea plant is a fluoride hyperaccumulator with high fluoride in leaves, which has many health benefits to human body. Tea pectin acetylesterase (PAE) may be related to fluoride accumulation and detoxification by regulating pectin deacytelation. However, few reports on tea PAEs were available. In the study, the identification and analysis of characteristic, evolutionary and subcellular localization of CsPAEs were performed by bioinformatics method based on tea genome database and three next-generation sequencing data ofvar. sinensis cv ‘Shuchazao’. The results indicate that 12 CsPAEs belonged to five members, including PAE5, PAE8, PAE9, PAE10 and PAE12. Nine conserved motifs including CLDG, PxYH, GGGWC, GS, NWN, rYCDg, GCSAG, NaAYDSWQ and HCQwere found in CsPAEs;CsPAEs were more closely related to PAEs ofandaccording toevolutionary relationship; Amino acid length, molecular weight and theoretical isoelectric point of 12 CsPAEs varies from 326-515, 36.7-56.9 kDa and 5.1-8.9, respectively. Except that CsPAE5 and CsPAE5-1 were predicated to be localized in the mitochondrion, and CsPAE10-1 might be present in cellular martix. The rest CsPAEs were predicated to be localized in the cell wall. CsPAE5, CsPAE5-1, CsPAE12 and CsPAE12-1 were transmembrane proteins. The results provided a foundation for functional analysis of CsPAEs involved in fluoride accumulation and detoxification.

tea plant (), pectin acetylesterase, identification, bioinformatics analysis

S571.1；S154.1

A

1000-369X(2019)05-521-09

2019-03-28

2019-04-23

湖北省农业科学院青年科学基金项目（2017NKYJJ05）、湖北省农业科技创新中心项目（2016-620-000-001-032）

刘艳丽，女，博士，主要从事茶树栽培育种与生物技术研究。*通信作者：jxf1130@126.com