Ghrelin在维生素D3和尼古丁诱导大鼠血管钙化中的作用

马 涛，王 倩，程治源，叶 挺，张宸铭，盛 瑛，宗刚军,

血管钙化(vascular calcification，VC)是高血压病、动脉粥样硬化、慢性肾衰竭以及糖尿病血管病变共同的病理学改变。有研究[1-2]表明VC过程复杂，与动脉粥样硬化、糖尿病和慢性肾病患者的心血管发病率和死亡率增加有关[3]。然而，目前并没有针对VC特效的治疗方法。

Ghrelin又称生长激素释放肽或胃饥饿素，是由氨基酸残基组成的小分子多肽[4-5]，在心血管系统方面，有研究[6-7]显示Ghrelin能够阻碍炎症细胞聚集和活化，延缓动脉粥样硬化的进展。而VC是动脉粥样硬化晚期继发性改变之一，由此可以推测Ghrelin在一定程度上可以抑制VC的发展。该研究拟建立大鼠VC模型，探讨Ghrelin与VC程度之间的作用，旨在寻找干预钙化的新靶点，为延缓VC进程提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料雄性SPF级SD大鼠40只由江苏省血吸虫病防治研究所(无锡)提供，平均8周龄，体质量160～250 g；尼古丁购自美国Merck公司；维生素D3(vitamin D3，VD3)购自美国Sigma公司，纯度>99%，Ghrelin购自杭州中肽生物有限公司，纯度> 99%；钙离子及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)试剂盒均购自北京索莱宝公司；骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、BMP-4试剂盒购自美国R&D公司；BMP-2、BMP-4、Ghrelin抗体及β-肌动蛋白抗体购自上海碧云天生物技术有限公司；其他试剂由杭州联科生物公司提供。

1.2 VC模型的建立及实验分组将40只同一批次SD大鼠随机分成4组，每组10只，分别为钙化组(vascular calcification，VC)、对照组(control，CON)、钙化+低浓度Ghre组(low concentration-Ghrelin，L-Ghre)、钙化+高浓度Ghre组(high concentration-Ghrelin，H-Ghre)。VC组：第1天8 ∶00 am用VD3溶解于无水乙醇(30万U/kg)肌肉注射，尼古丁溶解于花生油(25 mg/kg)8 ∶00 am，6 ∶00 pm各灌胃1次。CON组：同样时间用同等量的无水乙醇肌肉注射，花生油灌胃。L-Ghre组：用同钙化组相同方法建立模型的基础上给予Ghrelin 50 μg/kg，腹腔注射，每日1次，持续4周。H-Ghre组：在钙化模型基础上给予Ghrelin 100 μg/kg，腹腔注射，每日1次，持续4周。所有大鼠常规饲料、纯净水喂养，定期更换饲料、饮用水及垫料，每日观察并记录大鼠活力，每周称重。4周后4组大鼠称重后均在10%丙戊酸钠麻醉后心脏取血，3 000 r/min、10 min离心后取上清液，-80 ℃保存待测。解剖大鼠取胸主动脉1 cm，10%中性福尔马林固定留待切片染色。

1.3 Von Kossa切片染色将固定于10%中性福尔马林的1 cm胸主动脉常规脱水包埋，切片厚度5 μm常规脱蜡至水，蒸馏水洗1 min，切片入Von Kossa银溶液在紫外灯下强光照射30 min后蒸馏水再洗1 min，切片用海波溶液处理2 min后蒸馏水冲洗3次，HE染色复染细胞核，脱水透明，中性树胶封固。

1.4 血清Ca2+、ALP含量测定大鼠血清离心后上清液中的Ca2+、ALP含量用ELISA法进行检测，具体操作步骤按照试剂盒说明进行。

1.5 免疫组化法检测胸主动脉BMP-2、BMP-4表达石蜡包埋的血管组织切片4 μm，脱蜡洗涤，抗原修复，分别加入BMP-2、BMP-4抗体4 ℃过夜，复温洗涤后滴加二抗，洗涤加显色液后苏木精复染5～10 min。

1.6 胸主动脉BMP-2、BMP-4含量测定取大鼠胸主动脉段血管组织20 mg加入裂解液进行冰浴匀浆4 ℃、3 000 r/min离心10 min后取上清液，用 BMP-2、BMP-4 ELISA试剂盒测定其含量。

1.7 胸主动脉BMP-2、BMP-4、Ghrelin蛋白表达取胸主动脉并剪成细小碎片，加入终浓度为1 mmol/L的PMSF，每20 mg组织加入200 μl的RIPA裂解液并震荡裂解液，玻璃器匀浆至充分裂解，12 000 r/min离心5 min取上清液，加入上样缓冲液并煮沸，再次离心，其余步骤按照Western blot方法进行操作。

2 结果

2.1 Von Kossa染色观察4组大鼠胸主动脉VC程度通过Von Kossa染色切片观察可见CON组血管壁呈红色未见黑褐色钙盐沉积，VC组胸主动脉壁中层可见大量黑褐色至深黑色钙盐沉积，H-Ghre组钙化程度小于L-Ghre组，两组钙化程度均明显小于VC组，并且高于CON组，见图1。

2.2 4组大鼠体质量及血清Ca2+、ALP含量测定4组体质量差异无统计学意义(F=0.998，P>0.05)，ELISA法检测结果显示：L-Ghre组血清Ca2+、ALP含量均高于H-Ghre组和CON组，但低于VC组血清Ca2+、ALP含量，差异有统计学意义(F=64.102，P<0.05；F=66.390，P<0.05)。见表1。

2.3 相关钙化因子的表达免疫组化法检测4组大鼠胸主动脉BMP-2、BMP-4的表达：BMP-2、BMP-4在CON组几乎无表达，在VC组表达最明显呈棕黄色，H-Ghre组BMP-2、BMP-4的表达低于L-Ghre组(图2)。ELISA法测4组大鼠胸主动脉BMP-2、BMP-4含量，VC组含量最高，L-Ghre组高于H-Ghre组，CON组最低，差异有统计学意义(F=13.792，P<0.05；F=11.472，P<0.05)(表2)。Western blot结果显示：VC组中BMP-2、BMP-4的表达均较其他三组明显升高，H-Ghre组与L-Ghre组比较BMP-2、BMP-4表达均降低且高于CON组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图1 4组大鼠胸主动脉切片Von Kossa染色结果 ×200

项目VC组CON组L-Ghre组H-Ghre组F值体质量(g)385.10±12.65359.10±61.23#349.70±32.64#△356.70±10.25*#△0.998血清Ca2+含量(mg/dl)17.81±1.045.54±2.09#13.30±1.41#△8.47±1.29*#△64.102血清ALP含量(U/L)172.00±15.2145.95±14.71#117.10±18.05#△51.58±17.35*#△66.390

与L-Ghre组比较：*P<0.05； 与VC组比较：#P<0.05；与CON组比较：△P<0.05

图2 4组大鼠免疫组化法测胸主动脉上BMP-2、BMP-4表达 ×200

钙化因子VC组CON组L-Ghre组H-Ghre组F值BMP-2含量(pg/dl)175.38±23.8594.50±14.14#144.83±19.20#△125.34±9.04*#△13.792BMP-4含量(pg/dl)144.30±17.9089.67±16.04#131.30±12.35#△115.60±8.46*#△11.472

与L-Ghre组比较：*P<0.05； 与VC组比较：#P<0.05；与CON组比较：△P<0.05

图3 Western blot检测4组大鼠胸主动脉BMP-2、BMP-4的表达

2.4 4组大鼠胸主动脉Ghrelin蛋白表达差异检测相比于CON组，VC组给予尼古丁灌胃联合VD3肌注，Western blot结果显示VC组和CON组Ghrelin蛋白表达相比无统计学意义(P>0.05)，见图4。说明实验所用的建模方法并不会对大鼠体内Ghrelin水平产生明显影响。

图4 Western blot检测4组大鼠胸主动脉Ghrelin的表达

3 讨论

随着社会老龄化的日益加剧，VC显著增加了心血管病的发病率，因此受到越来越多的关注。VC是临床上比较常见的疾病，尤其在肾功能衰竭、脂质代谢异常及糖尿病血管病变的患者中更常见，既往的观点认为VC是钙盐在血管壁被动沉积的过程，是钙磷代谢紊乱的结果，炎症反应、细胞凋亡会加剧VC化进展[8]。近年研究[9]表明VC是多因素参与的与骨细胞代谢、软骨发育相关的一个可以主动调控的过程。本实验通过给予VD3和尼古丁建立大鼠VC模型，利用Von Kossa染色可以明显看到动脉中层有大量黑褐色钙盐沉积，通过ELISA法、免疫组化法以及Western blot方法检测可以看到钙离子、ALP及BMP-2、BMP-4等钙化相关指标明显增高，证实了可以通过VD3联合尼古丁可以成功建立大鼠VC模型。通过对钙化组和对照组的Ghrelin表达水平的检测，发现建模方法并不会影响大鼠自身Ghrelin水平。此外在建立VC模型基础上，实验组给予不同剂量的Ghrelin可以发现 L-Ghre组、H-Ghre组以及VC组之间钙化指标存在差异，H-Ghre组相关钙化指标低于L-Ghre组和VC组，并且有统计学意义，说明Ghrelin在一定程度上可以减轻VC的发展。

目前有关VC发生的机制更多倾向于多因素参与的并且是可以主动调控的过程，包括细胞表型转化(平滑肌细胞转化为成骨细胞)、炎症细胞的迁移与活化、细胞的自噬和凋亡等有关。本研究表明外源性Ghrelin在一定程度上有减弱钙化的作用且高剂量Ghrelin作用更明显，但其机制目前并没有完全明确，有国外研究表明通过抑制细胞凋亡因子Bax和Caspase-3的表达可以减轻细胞钙化，但并不是唯一机制[10-11]，也可以通过激活细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK1/2)和磷脂酰肌醇三磷酸激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)来抑制细胞凋亡减轻钙化[12-13]，因此可以猜测Ghrelin抑制VC的机制之一是通过激活ERK1/2和PI3K/Akt通路抑制Bax、Caspase-3等凋亡因子表达最终抑制VC的进展。脱酰基Ghrelin是Ghrelin发挥生物学效应的主要形式，有研究[14]显示脱酰基Ghrelin可以通过上调非编码RNA-126的表达增加沉默信息调节因子-1和超氧化物的水平歧化酶-2在外周血管内皮细胞中产生来保护内皮细胞抗氧化损伤，而血管内皮细胞氧化损伤是导致血管粥样硬化和钙化的启动因素之一，因此可以推测这或许是Ghrelin抑制VC的另一个可能机制。目前，有关Ghrelin的研究尚处于起步阶段，而且目前研究仅限于体外细胞水平，本实验通过建立大鼠VC模型更加逼真的模拟了体内环境，较体外实验有一定说服力，但存在Ghrelin浓度梯度分组少，未准确提出Ghrelin抑制大鼠VC的可能药物浓度范围，这有待进一步实验探索。目前Ghrelin在体内的作用机制尚不完全明确，但Ghrelin为临床上高危钙化患者减轻钙化提供了一个方向，要想作为临床上的治疗手段则需要进行更广泛的研究。