正交试验设计优选肝纤颗粒水提工艺*

卢雪盈 ，彭怡文 ，姜新根 ，王玉梅 ，赵金花 ，张尚斌 ，陈剑平 ，胡世平 △

（1.广东省深圳市龙岗区中医院，广东 深圳 518172； 2.广东省深圳市中医院·深圳市医院中药制剂研究重点实验室，广东 深圳 518033）

肝纤方又名益肝化瘀方，是深圳市龙岗区中医院胡世平主任医师的临床经验方，具有疏肝理气、活血化瘀、健脾祛湿的功效，主要用于治疗慢性肝纤维化、慢性肝病及终末期肝病，对兼有湿浊、血瘀等证疗效显著。为了方便服用并保证原方疗效，医院将其进一步研制成质量可控的中药颗粒剂。本研究中先确定醋鳖甲的先煎工艺，再采用正交试验对提取工艺进行优化。由于丹参中的丹酚酸B具有抗纤维化作用[1]，故以丹酚酸B为含量测定指标，并综合总固形物质量为评价指标。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT型高效液相色谱（HPLC）仪，包括柱温箱、自动进样器、二极管阵列检测器、LC solution色谱工作站（日本岛津公司）；AUW220D型电子天平（十万分之一，日本岛津公司）；CQ-250-DST型超声波清洗机（上海跃进医用光学器械厂）；LD5-2A型低速离心机（北京京立离心机有限公司）。

1.2 试药

柴胡、当归、赤芍、白芍、醋莪术、醋鳖甲、丹参、醋香附、党参、麸炒苍术、白术、茯苓、泽泻、黄芪、垂盆草、叶下珠、醋青皮、陈皮（深圳华辉药业有限公司，批号分别为 171104，20171102，17061001，17112901，17110601，17091001，17121001，1711083，17112601，20171018，171101，171101，1704001，20171202，170901，17051101，170701，1709030302），均经深圳市中医院张尚斌主任中药师鉴定为正品；丹酚酸B对照品（中国食品药品检定研究院，批号为 111562-201716，含量以94.1% 计）；乙腈为色谱纯（默克公司），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 先煎提取工艺考察[2]

因方中含有醋鳖甲药味，按传统工艺煎煮提取要求，需对其进行先煎考察。故本研究中采用单因素考察法，加水单煎醋鳖甲制得先煎考察样品，以水溶性固形物质量为评价指标，分别对药材粉碎粒度和提取时间进行考察。

水溶性固形物质量的测定[3]:精密量取各样品溶液50 mL，置已恒重的蒸发皿中，100℃水浴蒸干，于105℃干燥至恒重。按2015年版《中国药典（四部）》通则0831干燥失重测定法测定，计算固形物含量。

固形物含量（%）=（50 mL浓缩液中固形物质量×250）／（醋鳖甲质量 ×250）×100%

不同粉碎粒度的醋鳖甲单煎考察:取醋鳖甲的饮片、最粗粉、粗粉、中粉各50g，精密称定，分别加水500mL，煎煮1 h，过滤，浓缩，定容至250 mL，测定水溶性固形物质量，计算固形物含量。结果饮片煎煮所得固形物含量较低（8.21% ），最粗粉（10.19% ）、粗粉（9.88% ）、中粉（10.95%）的固形物含量差异不大。

不同煎煮时间单煎考察:取醋鳖甲最粗粉5份，各50 g，精密称定，加水 500 mL，分别煎煮 0.5，1.0，1.5，2.0 h，过滤，浓缩，定容至250 mL，测定水溶性固形物质量，计算固形物含量。结果固形物含量分别为 10.19%，10.82% ，10.72%，10.43%。可见，煎煮 0.5 h 后对固形物含量的影响差异不大。

综合固形物含量及时间成本等因素，醋鳖甲先煎提取优选工艺的粉碎粒度为最粗粉，先煎时间为0.5h。

2.2 水提取工艺考察

2.2.1 因素水平

根据前期预试验结果，分别以加水倍数（因素A）、提取次数（因素B）、煎煮时间（因素C）为考察因素，每个因素各取3个水平，采用L9（34）正交试验法，以丹参中丹酚酸B含量和总固形物质量为评价指标，进行优选。因素水平设计见表1。

表1 因素水平表

2.2.2 样品制备

按优选的先煎工艺条件，对醋鳖甲进行先煎提取，在醋鳖甲先煎提取液与药渣中，加入丹参、黄芪等17味药材，按表1所示正交试验因素水平表进行提取，滤过，合并滤液，滤液全部浓缩至约300 mL，用少量蒸馏水清洗浓缩锅多次，全部转移至500 mL容量瓶中，定容，摇匀，取适量浓缩液，4500 r／min离心5 min，取上清液，测定丹酚酸B含量和总固形物质量。

2.2.3 总固形物测定[4]

精密量取样品50 mL，置已恒重的蒸发皿，在水浴上蒸干后，参照2015年版《中国药典（四部）》通则2201浸出物测定法，于105℃下干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，立即称定质量，按公式计算总固形物含量。

总固形物质量（g）=（50 mL浓缩液中固形物质量／g×500 mL）／50 mL

2.2.4 丹酚酸B含量测定

色谱条件[5]:色谱柱为InertsilODS-SP柱（150mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈 -0.1% 磷酸溶液（22 ∶78，V／V）；流速为 1.2 mL ／min；二极管阵列检测器，检测波长为286 nm。

溶液制备:取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加80%甲醇溶解并制成每1 mL含丹酚酸B约1 mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。取2.2.2项下的样品溶液适量，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按优选的先煎工艺条件，对醋鳖甲进行先煎提取，在醋鳖甲先煎提取液与药渣中，加入黄芪等16味药材（除丹参外），加10倍量水，提取2次，每次2 h，制得不含丹参的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

专属性试验:取上述3种溶液各10 μL，按拟订色谱条件进样测定。结果阴性对照品溶液色谱中，在与丹酚酸B、供试品溶液色谱相应位置上无色谱峰出现，表明方法专属性良好（见图1）。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:精密吸取对照品溶液（1060μg／mL），加 80% 甲醇制成每 1 mL 含 1000，800，600，400，200，100，80，60，40，20 μg 的溶液。按拟订色谱条件进样，测得峰面积。以进样量（，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=1065 467.411-23845.970，r=0.9999（n=10）。结果表明，丹酚酸 B进样量在 0.1036 ～4.1440 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度、重复性、稳定性及回收率试验:按相关方法进行操作，结果精密度、重复性、稳定性（24 h）试验结果的RSD均小于2.0%（n=6），平均加样回收率为98.85%，表明该方法稳定、可行。

2.2.5 水提正交试验结果

采用综合加权评分法[4]，以总固形物质量和丹酚酸B含量9次试验的最大值为100分，将各指标成分的总量转换为评分值，考虑到丹参在处方中为君药，故总固形物质量和丹酚酸B含量的加权系数分别设为0.5，进行综合评价，筛选最佳工艺。结果见表2和表3。

表2 正交设计试验结果

可见，提取条件以A3B3C3为佳。方差分析结果表明，提取次数对丹酚酸B含量和总固形物质量具显著性差异，且差异主要来源于第1水平与第2水平，而第2水平与第3水平差异不显著，故选择第2水平，即提取2次。综合考虑，各因素影响水平为提取次数（B）＞加水量（A）＞提取时间（C），综合考虑到缩短生产周期、降低生产成本等，故确定优选提取工艺为黄芪、丹参等17味药材，加10倍量水，提取2次，每次1 h。

2.3 验证试验

为验证水提工艺的可行性，进行3批重复验证试验。每批称取黄芪、丹参等18味药材，照先煎工艺优选结果和正交试验最佳提取工艺条件进行提取，并测定水提液中丹酚酸B和总固形物质量，计算综合评分值。结果见表4。可见，3次平行试验的干膏得率的平均值为31.25%，平均综合评分为95.20分，与正交试验综合评分最大值的结果接近，提示所筛选的提取工艺条件基本稳定。

表4 优选提取工艺验证试验结果

3 讨论

3.1 提取工艺设计

肝纤方中有多味含挥发油成分的中药，但收集以水提取的挥发油量较少，根据挥发油提取预试验结果及处方中挥发油的性质分析，可能由于挥发油含量低、不稳定、水溶性大[3]等因素，将所有药材直接用水提取，成本低、安全性高，且与传统工艺相契合[6]。

本研究中采用单因素试验法考察醋鳖甲先煎工艺、以正交试验法考察水提工艺，2种方法结合研究该处方的提取工艺，一方面可明显缩短研究的时间，降低研究成本；另一方面可保证原方的提取效果[7]，尽可能与传统工艺保持一致，从而为充分发挥临床疗效提供基础。采用正交试验进行水提工艺优化，综合考虑提取过程的各种影响因素，明确各因素的影响程度和相互作用，获得诸因素各水平的最佳搭配，结合实际生产优选最佳工艺条件。预试验结果表明，当水提液浓缩至相对密度大约为 1.20（70 ～80 ℃）时，与辅料（糊精、蔗糖粉）混合，利于颗粒的成型，颗粒外观、均一度、成型率和溶化性等均符合药典标准，进一步提示该方水提工艺合理、可行。

3.2 指标成分选择与综合评分权重比例

丹参为方中君药，结合预试验结果，指标成分选择其水溶性有效成分丹酚酸B。测定方法参照药典方法，结果丹酚酸B色谱峰分离良好，与其他成分不互相干扰，保留时间适中。曾考察以丹酚酸B和丹参酮为正交试验的指标成分，建立多指标成分评价方法，综合优选水提工艺。但由于丹参酮为脂溶性成分，在水提液中含量较低，故最终仅选取丹酚酸B作为正交试验的指标成分。同时，试验过程中发现丹酚酸B受热易分解[8]，因此供试品处理后应及时测定丹酚酸B含量，避免产生误差。

中药制剂的提取工艺正交试验多以干膏率为指标，其方法多数参照2015年版《中国药典（四部）》通则0831干燥失重测定法。本试验中正交试验起初也参照干燥失重测定法测定干膏率，然而难以达到药典中“恒重”的标准。推测当干膏率较高时，经过较长的加热时间导致浸膏受热面积不均匀，部分出现炭化，因此难以确保恒重。因此本试验参照2015年版《中国药典（四部）》通则2201浸出物测定法，作为总固形物测定法。

由于丹参为本方君药，且方中药味较多，因此综合评分权重比例中，丹酚酸B含量与总固形物质量各占评分比重的50%。本研究选择的指标成分是参考2015年版《中国药典》中药材饮片的主要成分，其含量不能完全反映制剂的疗效，故还需结合药效和毒理试验，确定制剂主要疗效成分及限定，确定更加科学的提取工艺。

3.3 研究价值

本研究中试验方法操作简便，优选出的提取工艺稳定性好，可为将肝纤方进一步开发成中药制剂提供重要的试验参考。