COPD不同时期诱导痰中IL-8、IL-17、PMN表达水平的差异及临床意义

全 斌，段 纯，秦立龙，喻艳林，王 妮，鲁 俊

(1.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 a.感染性疾病科;b.呼吸内科，安徽 芜湖 241001；2.皖南医学院第二附属医院 全科医学科，安徽 芜湖 241000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD) 是呼吸系统最常见的慢性疾病之一，全球每年有275万人因COPD而死亡，病死率位居所有死亡原因的第3位，且发病率及病死率仍逐年升高[1]。COPD按病程可分为两期:①急性期，在短期内出现咳嗽、咳痰、喘闷加重、痰量增多，脓性或黏液脓性痰，可伴有发热等炎症明显加重症状;②稳定期，是指咳嗽、咳痰、气短等症状稳定或症状轻微[2]。 COPD发病机制复杂,目前研究多侧重于监测炎性因子在患者血液中的变化，不能直接反映气道炎症水平。而诱导痰术是一种安全、有效、简便、可重复性强的检测方法，其为自然状态下的气道分泌物，具有更集中的细胞和生化物质成分，近些年来诱导痰术在慢性气道炎症机制研究中越来越受重视[3]。本研究检测COPD患者诱导痰中白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-17(IL-17)、中性粒细胞(PMN)表达情况，以阐明气道炎性因子在COPD不同时期的免疫机制，并探讨炎性因子在评估患者病情和预后中的应用价值，为COPD 防治感染寻找新的治疗靶点。

1 资料和方法

1.1 研究对象 2016年9月～2018年9月在弋矶山医院和皖南医学院第二附属医院接受诊疗的80例COPD患者作为研究对象(急性期、稳定期的COPD各40例);其中COPD急性期患者中男22例，女18例，年龄56.1～75.7岁，平均(65.93±10.85) 岁，26例患者有吸烟史；COPD稳定期男23例，女17 例，年龄56.3～75.3岁，平均(65.71±10.01) 岁，27例有吸烟史；并以同期40例体检者作为对照组，男21例，女19 例，年龄55.1～74.5岁，平均(64.74±9.75) 岁，24例有吸烟史。3组间的性别、年龄、吸烟史等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。COPD的诊断以及分期判断依据中华医学会呼吸病学分会制订的“慢性阻塞性肺疾病诊治指南”[2]。肺结核、支气管扩张、支气管哮喘、肺癌等其他慢性呼吸系统疾病以及全身炎性疾病等除外。研究方案经医院医学伦理委员会批准，所有研究对象均获得知情同意。

1.2 诱导痰的采集和处理

1.2.1 采集操作过程 ①雾化前清水漱口、擤鼻;②诱导前10 min让患者吸入沙丁胺醇200～400 μg;③3%高渗盐水超声雾化吸7 min，用力咳痰至无菌培养皿；若患者无痰或痰量不足则梯度增加盐水浓度，直到患者能咳出深部的痰液。痰诱导以7 min为间隔，总时间≤21 min。

1.2.2 诱导痰的处理 将合格痰液标本加入4倍体积的0.1%二硫苏糖醇充分混合，37℃恒温培养30 min、震荡、稀释、离心后取上清，置于-80℃冰箱保存备检。

1.3 血清的采集和处理 清晨采集研究对象空腹静脉血4 mL，迅速离心分离血清，置于-80℃冰箱保存。

1.4 IL-8、IL-17水平的测定 采用酶联免疫吸附法(ELISA)集中测定诱导痰IL-8、IL-l7浓度，IL-8试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司，IL-17试剂盒购自武汉爱博泰克生物科技公司，用酶标仪在450 nm波长下依序测定吸光度，计算IL-8、IL-17的浓度值。所有操作均严格执行各自产品说明书。

1.5 痰液PMN计数检测 在光学显微镜下直接计数500 个诱导痰液沉淀细胞进行分类,包括PMN、嗜酸粒细胞、单核细胞和上皮细胞等。

1.6 BODE评分 按照Celli设计的BODE 评分标准对40例稳定期COPD患者进行评分[4]。B为体质量指数，O是气流阻塞，D是呼吸困难，E是运动能力。BODE评分标准：总分为0～10分;0～2分为1级,3～4分为2级,5～6分为3级,7～10分为4级，见表1。

表1 BODE 指数评分标准

项目0分1分2分3分BMI/(kg/m2)>21≤21--FEV1%pred≥6550～6436～49≤35MMRC/级0～12346MWD/m≥350250～349150～249≤149

注：-表示此项无数据。

1.7 统计学方法 使用SPSS 18.0进行统计分析和处理。定量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析(q检验)；两变量间采用直线相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组研究对象诱导痰中IL-8、IL-17和PMN的表达水平的对比 见表2。COPD在急性期的诱导痰中IL-8、IL-17和PMN与稳定期组相比均升高(P<0.05)；另外COPD稳定期的患者诱导痰中IL-8、IL-17和PMN水平高于健康对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表2 3组研究对象诱导痰中IL-8、IL-17和PMN的表达

组别nIL-8/(ng/L)IL-17/(ng/L)PMN/%急性期40121.18±17.9873.80±8.0159.43±8.63稳定期4092.20±7.09∗41.61±6.32∗52.43±6.59∗健康对照组4060.69±6.56∗#22.86±8.21∗# 37.74±9.61∗#F263.658464.43070.087P<0.001<0.001<0.001

注：*与急性期COPD患者比较，P<0.05；#与稳定期COPD患者比较，P<0.05。

2.2 3组研究对象血清和诱导痰中IL-8、IL-17的对比 见表3。对于COPD患者除稳定期的IL-17外，诱导痰中炎性因子水平均高于血清检测水平，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 3组研究对象诱导痰、血清中IL-8、IL-17水平的比较

IL-8/(ng/L)诱导痰血清tPIL-17/(ng/L)诱导痰血清tP急性期121.18±17.98110.10±19.007.273<0.00173.80±8.0166.46±12.204.910<0.001稳定期92.20±7.0977.98±13.486.762<0.00141.61±6.3238.91±10.291.9840.054健康对照组60.69±6.5657.65±11.901.7960.08022.86±8.2124.48±8.891.7650.085

2.3 稳定期COPD 患者诱导痰中IL-8、IL-17、PMN的表达水平与 BODE指数的相关性 COPD 稳定期患者诱导痰 IL-8、 IL-17、PMN与 BODE指数均呈正相关(r=0.804、0.742和0.637，P<0.001)。见图1～3。

图1 稳定期COPD诱导痰中IL-8与BODE 指数的关系

图2 稳定期COPD诱导痰中IL-17与BODE 指数的关系

图3 稳定期COPD诱导痰中PMN百分比与BODE指数的关系

2.4 诱导痰中IL-8与IL-17的相关性分析 COPD急性期、稳定期和健康对照诱导痰中IL-8与IL-17的水平均呈正相关(r=0.795、0.826 和0.361，P<0.05)。

3 讨论

COPD的病理特征是多种炎性因子参与的慢性气道炎症，PMN的活化和聚集是 COPD 炎症过程中一个重要环节[5]。通过表1我们可知PMN为COPD患者痰液中的主要炎症细胞，当COPD处于急性期时诱导痰中PMN(59.43±8.639)%不仅高于健康对照组，也要高于稳定期，差异有统计学意义(P<0.05)。PMN是炎症部位的“第一反应者”，在人类先天免疫系统中发挥重要作用。趋化作用是指白细胞(主要为PMN)沿某些化学刺激物浓度梯度作定向移动，这些化学刺激物称为趋化因子，这也是机体调节PMN的募集主要机制[6]。 本课题组比较了COPD不同时期诱导痰中IL-8和IL-17表达水平的变化，结果显示急性期患者诱导痰液中IL-8、IL-17的含量均高于稳定期组(P<0.05)，说明IL-8、IL-17参与了COPD急性发病的炎性损伤过程。 IL-17是由活化的CD4+T淋巴细胞、单核细胞产生的一种前炎症细胞因子，与慢性气道炎症性疾病的关系密切[5]。 IL-17能诱导支气管上皮细胞、气道平滑肌细胞等多种细胞产生抗菌肽和大量趋化因子如IL-8、TNF-α、粒细胞集落刺激因子与黏附因子等，从而促进炎症状态下的PMN在气道的募集[7]。IL-17促使PMN分泌弹性蛋白酶，诱发支气管痉挛；增加CD8+T细胞在气道壁表达，促进树突状细胞成熟，造成气道损伤重构；另外IL-17还能与多种细胞因子产生协同作用以放大气道炎症效应[8]。1986年Kownatyki首先发现IL-8，最初称为单核细胞衍生PMN趋化因子。IL-8未受到刺激时可无表达或少量表达,但在细菌、病毒、低氧、过氧化物等刺激后可大量产生。单核细胞是IL-8的主要来源,另外内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肺泡巨噬细胞等都有IL-8信使转录RNA(mRNA)的表达。 IL-8对PMN 的趋化作用显著，可促进激活后的PMN 和内皮细胞黏附，并诱导PMN脱颗粒，释放弹性蛋白酶、胶原酶、组织蛋白酶等引起肺毛细血管、肺泡等损伤，此外其还可通过抑制凋亡增加粒细胞的数量而加重肺损伤[9]。

与Garcia-Rio的研究结果[10]相似，通过表2我们也发现 COPD 即使处于稳定期其诱导痰中IL-8、IL-17和PMN也未降至正常水平,这种高水平的IL-8、IL-17和PMN提示COPD在稳定期仍存在持续高表达状态的气道炎症，持续的气道炎症可能会导致患者肺功能、生活质量的下降及病程的不断进展与加重，这也是COPD迁延不愈的重要原因。BODE指数作为一种新的评估 COPD 患者病情及预后的多维分级系统，涵盖了功能性指标与生理学指标。 BODE指数得分越高，代表病情越严重，预后越差。COPD不仅是一种以不完全可逆性气流受限为特征的气道疾病，更是一种伴随全身不良效应的系统性疾病，全身效应的出现已被证实与血液中炎性因子浓度增高、活化等有关。而在我们的研究中发现了COPD 稳定期诱导痰中IL-8、IL-17和PMN水平越高BODE指数评分也越高，且呈中等以上程度的正相关性(P<0.05)。因此痰液中炎性因子水平也可作为评估COPD全身效应严重程度和预后的有效指标[8]。

最后本研究还发现COPD两个时期内诱导痰中IL-8 与 IL-17均呈正相关性(急性期r=0.795，P<0.05，稳定期r=0.826，P<0.05)，说明两者存在一定相关性，这可能与IL-17 诱导 IL-8有关。IL-17可触发诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，产生一氧化氮等，这些自由基可增加IL-8 mRNA，导致IL-8蛋白的表达[7]，因此IL-17对PMN的趋化、活化作用是间接的，是通过介导IL-8来完成的。未来进一步研究气道炎性因子的产生及其生物活性，通过抑制1L-8、IL-17的产生或者切断IL-17对 IL-8的诱导作用，可为COPD 的治疗提供一个新的方向。例如近期Anzalone等[7,11]研究表明由抗胆碱能药物如噻托溴铵处理后的人支气管上皮细胞，催化组蛋白H3的Lys14发生乙酰基化，支气管细胞染色质重塑，导致IL-17活性下降，其诱导的IL-8也相应减少，因此具有降低气道炎症，延缓肺功能恶化的作用。

综上所述，COPD 是以PMN浸润为主的气道非特异性炎症。PMN在内源性趋化因子IL-8 等作用下，通过促炎因子IL-17 等调控，聚集于气道，导致急性期的肺组织损伤，另外它们还参与了稳定期的气道重塑、慢性炎症，贯穿COPD 病程始终。因此监测COPD诱导痰中IL-8、IL-17、PMN的变化，不仅对病情评估、疗效评价有重要的临床价值，还可为“靶向”药物的研究提供理论基础，为未来COPD的治疗提供新的选择。