延龄草苷对脊髓损伤大鼠核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件信号通路的影响

杜俊龙，陈显兵,，王凤杰,，覃晓莉，赵方毓，唐鲜娥

1.湖北民族大学附属民大医院，湖北恩施市 445000；2.湖北民族大学医学部，湖北恩施市 445000

脊髓损伤指不同方式外力使脊柱发生爆裂、移位，伤及椎管内脊髓组织，从而造成脊髓神经损伤性疾病[1]。脊髓损伤包括原发性损伤和继发性损伤[2]。继发性脊髓损伤有一定的可逆性和可干预性，已成为近年来的研究热点，其发生机制主要有氧化应激、细胞凋亡、炎症反应学说等，而氧化应激损伤在继发性损伤发生机制中起关键作用[3]，亦是引起组织损伤和神经细胞死亡的主要原因之一[4]。近年来发现的机体内源性抗氧化核因子E2 相关因子2/抗氧化反应元件(nu‑clear factor E2‑related factor 2/antioxidant response ele‑ment,Nrf2/ARE)信号通路可抵御损伤所致的氧化应激反应，因而在脊髓损伤的防御中起重要作用[5]；激活Nrf2/ARE 通路可促进抗氧化酶、抗炎蛋白、DNA 修复酶等下游分子表达，从多方面保护脊髓继发性损伤[6‑7]，因此该通路可能成为治疗脊髓损伤的新靶点。

延龄草(Trillium tschonoskii Maxim)是百合科延龄草属多年生草本植物，在恩施土家族地区民间应用较多，有活血止血、镇静止痛、解毒等功效[8]。现代药理研究显示，延龄草有抗氧化[9]、抗衰老[10]等作用，且前期已证实延龄草可通过调节自噬、抑制细胞凋亡来达到保护脊髓损伤的作用[11]。本研究采用延龄草干预脊髓损伤模型大鼠，探讨延龄草能否通过Nrf2/ARE信号通路抑制体内氧化应激反应，从而发挥脊髓损伤保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级健康雄性Sprague‑Dawley 大鼠108 只，10周龄，体质量200～220 g，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号SCXK(鄂)2015‑0018。实验动物正常进食和饮水，分笼饲养，自然光照周期，维持室温23 ℃，湿度56%左右。实验动物操作均符合动物伦理委员会制定的实验动物操作标准，接受湖北民族大学动物伦理委员会的监督与检查。

1.2 实验动物分组与处理

大鼠称重标记，随机数字表法分为假手术组、模型组和延龄草苷干预组，每组36只，每组再分为1 d、3 d和7 d三个亚组，每个亚组12只。假手术组只切开椎板，不打击脊髓；模型组和延龄草苷组切开椎板，并打击脊髓，建立脊髓损伤模型。术后待大鼠苏醒2 h 后进行灌胃，延龄草苷组给予200 mg/kg 延龄草苷，假手术组和模型组给予等量生理盐水，每天2 次，间隔12 h，连续给药7 d。

1.3 模型制备

实验动物称重，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后，采用改良Allen 重物打击法制备脊髓损伤模型[11]。大鼠俯卧位固定于手术台，备皮，碘伏消毒，铺巾，切除T9～T11棘突及椎板，暴露硬脊膜，用5.0 g重物从5 cm 高度自由落下撞击暴露区。造模成功标志：在脊髓打击器撞击脊髓时，大鼠发生身体抖动，双下肢迅速回缩及弹动，尾巴发生痉挛性摆动，打击局部脊髓表面红肿。撞击后以消毒温盐水、庆大霉素清洗，之后依次缝合肌肉、筋膜、皮肤，敷料覆盖伤口，加以固定并肌注青霉素。

1.4 实验药物、试剂及仪器

延龄草采于湖北神农架及巴东地区，经湖北民族大学中药实验室鉴定，并提取延龄草苷，总皂苷含量为14.72 mg/g。注射用青霉素钠：华北制药股份有限公司。水合氯醛、二甲苯、无水乙醇：天津市福晨化学试剂公司。苏木素染剂：福州迈新生物技术公司。ELISA 试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司。Nrf2抗体、Kelch 样ECH 关联蛋白1 (Kelch like ECH asso‑ciated protein 1,Keap1)抗体：美国ABCAM 公司。An‑ti‑rabbit IgG、Anti‑mouse IgG：美 国CELL SIGNAL‑ING TECHNOLOGY 公司。Western blotting其余试剂：上海碧云天生物技术有限公司。自由落体脊髓损伤模型打击器：安徽正华生物仪器设备有限公司。TC‑120 型智能程控生物组织自动脱水机、TB‑718E 型生物组织自动包埋机：湖北泰维科技实业有限公司。全波长酶标仪：美国THERMO FISHER 公司。Western blotting 仪：美国BIO‑RAD 公司。移液器：德国EP‑PENDORF公司。

1.5 检测指标

1.5.1BBB评分

脊髓损伤模型制备成功后，各组分别于术后1 d、3 d、7 d 进行BBB 评分[12]。将大鼠放置于测试平台，采用盲法观察大鼠下肢运动功能状态，由熟悉实验评分标准的非本组实验人员评分，观察下肢关节活动、步态、躯干的稳定性、爪的精细活动、尾的位置以及身体的协调性等，观察时间不少于5 min，每只3 次，评分0～21 分。0 分：无可见后肢运动，完全瘫痪。21分：持续性掌面移动、协调步态、足趾抓地、躯干稳定、尾巴翘起，活动过程中主动爪位置与身体始终平行，完全正常活动。评分前检查大鼠膀胱充盈状态，协助排尿，以免影响评分结果。

1.5.2尼氏染色

术后7 d 每组随机取4 只，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射后，固定于操作台，暴露心脏，先用250 ml生理盐水灌流，再用4%多聚甲醛灌注至四肢僵硬，取T9‑11段脊髓组织放于4%多聚甲醛液中浸泡保存，然后梯度脱水透明，常规石蜡浸蜡包埋，切片，片厚5 μm。切片热水烫平，再贴到载玻片上，45 ℃恒温箱中烘干。依次浸入二甲苯I10 min，二甲苯Ⅱ10 min，无水乙醇I3 min，无水乙醇Ⅱ3 min，90%乙醇3 min，80%乙醇3 min，70%乙醇3 min，水洗，蒸馏水洗，尼氏染液10 min，蒸馏水洗2 次，70%乙醇1 min，90%乙醇1 min，无水乙醇Ⅱ1 min，无水乙醇I1 min，二甲苯Ⅱ1 min，二甲苯I1 min，烤干，中性树脂封片，光学显微镜观察脊髓损伤区形态学改变。

1.5.3ELISA

术后7 d各组取4只大鼠，同法麻醉，心尖灌流生理盐水，无血后立即冰上取脊髓组织，将其剪碎匀浆研磨，根据ELISA 试剂盒说明书进行实验操作，用全自动酶标仪检测，根据检测结果计算丙二醛(malonal‑dehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dis‑mutase,SOD)活性。

1.5.4Western blotting

术后1 d、3 d、7 d，各组取4 只大鼠，与ELISA同法取脊髓组织蛋白，制备蛋白样品，BCA 蛋白定量，根据说明书制胶，将样品置于100 ℃水煮5 min，SDS‑PAGE 电泳，提前将PVDF 膜放甲醇中浸泡10 min，转膜，用5%脱脂牛奶室温摇床封闭3 h，TBST洗3 次，每 次5 min，加Nrf2 (1∶800)、Keap1 (1∶800)、NAD(P)H醌氧化还原酶‑1 (NAD(P)H quinone oxidoreductase,NQO1,1∶1000)、血红素加氧酶‑1(haem oxygenase 1,HO‑1,1∶1000)的一抗4 ℃孵育过夜，TBST 洗3 次，每次5 min，加相应二抗(1∶5000)室温摇床孵育2 h，TBST洗3次，每次5 min，ECL发光检测，Image J软件分析条带，以β‑actin为内参照。

剩余大鼠用于其他实验。

1.6 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析。计量资料数据结果以(xˉ±s)表示，符合正态分布采用多个样本均数比较的方差分析，组间比较采用单因素方差分析和SNK 检验，两两比较采用LSD‑t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 BBB评分

假手术组在术后1 d、3 d、7 d三个时间段BBB评分均为21分。与模型组相比，术后3 d和7 d，延龄草苷组BBB评分均增加(P＜0.05)。见表1。

2.2 形态学变化

假手术组神经元结构完整清晰，胞质内尼氏小体丰富且分布均匀，呈虎斑状；模型组脊髓组织内神经元胞体缩小，细胞间隙增大，神经元数量减少，形态不规则，胞质内尼氏小体数量减少甚至消失，且分布不均匀；延龄草苷组脊髓结构较完整，尼氏小体数量增多，且分布比较均匀，神经元形态较正常。见图1。

表1 各组BBB评分比较

2.3 MDA含量和SOD变化

与假手术组比较，模型组脊髓组织内SOD活性降低(P＜0.05)，MDA 含量升高(P＜0.05)；与模型组比较，延龄草苷组脊髓组织SOD 活性提高(P＜0.05)，MDA含量降低(P＜0.05)。见表2。

表2 各组脊髓组织中SOD和MDA的变化

2.4 Nrf2通路相关蛋白表达水平

术后1 d、3 d、7 d，与假手术组相比，模型组脊髓组织中Nrf2、Keap1、HO‑1 和NQO1 4 种蛋白表达均升高(P＜0.05)；与模型组相比，延龄草苷组均进一步升高(P＜0.05)。见表3～表5、图2～图4。

3 讨论

脊髓损伤过程中活性氧诱发的氧化应激反应是其重要损伤机制之一。大量活性氧产生会导致蛋白、脂质及DNA 损伤，引起不可逆性细胞死亡[13]；抑制氧化应激可减轻脊髓损伤程度，保护神经元，促进运动功能恢复[14‑16]。前期研究证实[11,17]，头顶一颗珠提取液可以减轻脊髓内神经细胞损伤，对损伤神经元具有保护作用。本研究发现，延龄草干预3 d 和7 d 时大鼠BBB 评分均明显升高，表明脊髓运动功能得到改善；形态学检测亦可见脊髓结构较完整，损伤性改变减轻，且尼氏小体数量增多、分布均匀。延龄草是中药头顶一颗珠中的主要活性成分，可通过抗炎、抗氧化、提高免疫力等多种途径来保护损伤细胞，从而促进脊髓损伤后运动功能恢复。为进一步研究延龄草苷保护脊髓损伤的作用机制，本研究从抗氧化应激角度探讨延龄草的作用。

图1 各组脊髓组织神经元尼氏小体的变化(尼氏染色，×200)

表3 各组术后1 d脊髓组织内Nrf2、Keap1、HO-1和NQO1的表达

表4 各组术后3 d脊髓组织内Nrf2、Keap1、HO-1和NQO1的表达

表5 各组术后7 d脊髓组织内Nrf2、Keap1、HO-1和NQO1的表达

图2 各组术后1 d脊髓组织内Nrf2、Keap1、HO-1和NQO1的表达

图3 各组术后3 d脊髓组织内Nrf2、Keap1、HO-1和NQO1的表达

图4 各组术后7 d脊髓组织内Nrf2、Keap1、HO-1和NQO1的表达

脊髓组织富含脂质，对脂质过氧化非常敏感。自由基介导的氧化应激在脊髓损伤中发挥重要作用，亦是继发性脊髓损伤的重要机制之一，抑制氧自由基产生可能是脊髓损伤潜在的治疗方法[18]。Nrf2/ARE信号通路是机体内重要的抗氧化应激通路，在氧化应激损伤中发挥重要作用[19‑20]，Nrf2 可与多种抗氧化反应元件相结合，介导抗氧化蛋白/酶的表达。生理状态下Nrf2 结合到Keap1 上，Nrf2 活性抑制；而氧化应激情况下Nrf2 从Keap1 上解离并活化、转移到细胞核中，激活靶基因转录，调节下游抗氧化蛋白合成，增加细胞对氧化应激的抵抗性[21]。该通路调控的抗氧化蛋白/酶主要包括HO‑1、NQO1、SOD 和GSH‑Px 等[22]。我们发现延龄草苷干预可提高脊髓组织内SOD活性，降低脂质过氧化产物MDA 含量，减轻脊髓损伤后氧化应激反应，从而保护细胞氧化性损伤。

HO‑1 是血红素降解的限速酶，广泛分布于各组织中，在机体应激状态下发挥重要作用；诱导HO‑1的表达或激活，可明显抑制氧化应激反应，促进脊髓运动功能的恢复[23]。NQO1 是真核生物细胞中普遍存在的一种黄素蛋白酶，具备抗氧化能力[24]，在氧化应激反应中起保护作用。Kaspar 等[25]的研究显示，NQO1 为Nrf2 的下游产物，Nrf2 的激活可刺激NQO1的表达。Keap1 是Nrf2/ARE 通路上的关键因子，NQO1、HO‑1 是该通路激活后细胞保护蛋白的转录因子。本研究通过Western blotting 分析检测脊髓组织内Nrf2 通路中相关蛋白的表达水平，发现脊髓损伤后Nrf2、Keap1、NQO1 和HO‑1 蛋白表达升高，可能是损伤使Nrf2 和Keap1 解离而活化，表达增加，进而激活下游靶蛋白NQO1 和HO‑1，表明脊髓内出现明显的抗氧化应激反应。而延龄草苷干预1 d、3 d和7 d时均可增加Nrf2 通路相关的4 种蛋白表达，进一步活化Nrf2/ARE通路，诱导抗氧化蛋白NQO1和HO‑1表达，增强机体自身抗氧化能力，从而减轻内源性损伤。本研究仅检测脊髓内总Nrf2表达水平，尚未进行Nrf2入核及核内表达水平检测，因此还需深入探讨其作用机制。

综上所述，延龄草苷干预促进脊髓损伤大鼠运动功能恢复，减轻组织损伤，可能是通过激活Nrf2/ARE信号通路来抑制组织内氧化应激反应来实现的。