香烟尘雾颗粒经鼻腔滴入建立小鼠COPD肺功能损伤模型*

贾 敏， 樊文花， 秦巧红， 张 寒， 陈玉龙△

(西安医学院 1基础与转化医学研究所， 2药学院生药教研室， 陕西 西安 710021)

目前，常用的慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) 动物模型大多是将实验动物暴露于香烟烟雾[1]或直接给予蛋白水解酶[2]和炎症刺激物(如脂多糖)[3-6]等来诱导产生，但不论哪种造模方法均或多或少具有成模时间长、操作复杂、对动物造成创伤或成模不稳定等缺点[7-14]。研究表明，香烟烟雾通过鼻腔直接吸入吸烟者肺中[15]，可引起气道、肺实质和肺血管的慢性炎症病变[16]，破坏肺弹力纤维，导致肺通气功能下降[17]，从而导致慢性阻塞性肺疾病。因此本研究拟采用香烟尘雾颗粒(cigarette dust particles, DSP)通过滴鼻途径建立小鼠COPD肺功能损伤模型，并对造模的效果进行评价，以期为研究COPD发病机制选择更为简便稳定的动物模型。

材 料 和 方 法

1 动物

SPF级雄性BALB/c小鼠60只，8周龄，体重18～22 g，购自第四军医大学实验动物中心，许可证号为SYXK(陕)2016-004。在基础与转化医学研究所SPF级实验动物中心饲养，自由饮水，饲以普通动物饲料，室温控制在19～26 ℃，湿度控制在40%～70%，换气次数控制在每小时10～20次，气流控制在0.13～0.18 m/s，12 h光照/黑暗交替，噪音小于60分贝，本动物实验步骤经西安医学院伦理委员会批准。

2 主要试剂

戊巴比妥钠购自Merck；乙酰甲胆碱(methacholine, Mach)和脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)均购自Sigma；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

3 主要方法

3.1香烟烟雾颗粒溶液制备 本方法参考美国肯塔基大学的烟雾提取法[18]，取3支万宝路牌香烟(含焦油12 mg、烟碱0.9 mg和烟气一氧化碳12 mg)，除去滤嘴，用装有1 mL的二甲基亚砜或蒸馏水的水烟斗收集烟雾，用真空吸尘器接水烟斗，水烟斗接口用无菌的棉花滤过。最终取得香烟烟雾颗粒溶液(即DSP)，无菌条件下吸取上述方法制备的DSP 3 μL于2 mL离心管中，加1 mL无菌生理盐水，涡旋振荡仪混匀，配制成3 mL/L溶液，后根据实验需要稀释，临用临配。

3.2DSP诱导小鼠慢性肺功能损伤模型 BALB/c雄性小鼠60只，适应性饲养1周后开始实验，随机分为5组:(1)生理盐水对照(control, control)组；(2)LPS 100 mg/L组；(3)DSP 0.75 mL/L；(4)DSP 1.5 mL/L组；(5)DSP 3 mL/L组，每组12只。乙醚短时麻醉后，每天分别滴鼻给予上述各组溶液，每只20 μL，连续30 d。

3.3FlexiVent肺功能检测法 各组小鼠按100 mg/kg腹腔注射戊巴比妥钠，待其达深度麻醉自主呼吸消失后，进行气管插管，将插管与FlexiVent肺功能检测仪相连，在含氧21%、呼吸频率150次/分、潮气量10 mL、呼吸末正压力2 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)状态下进行机械通气，待呼吸平稳后，雾化给予乙酰甲胆碱(浓度依次递增：0、1.5、3、6、12、25、50和100 g/L)间隔时间为2 min，雾化时间为20 s，诱发小鼠支气管平滑肌痉挛。同时检测气道阻力(Rrs)、气道弹性阻力(Ers)、动态顺应性(Crs)、主气道阻力(P-3/8Rn)、组织衰减(P-3/8G)、组织弹性(P-3/8H)、准静态弹性(Est)和准静态顺应性(Cst)。

3.4Myograph气管环张力检测法 取上述造模方法处理的BALB/c小鼠，处死后分别取出气管和肺组织置于4 ℃预冷的PSS缓冲液(NaCl 119 mmol/L，KCl 4.6 mmol/L，NaH2PO4·2H2O 1.2 mmol/L，MgCl·6H2O 1.2 mmol/L，NaHCO31.5 mmol/L，Glu 5.5 mmol/L，CaCl21.5 mmol/L)中，在体视显微镜下，分离出主支气管，并在右侧主支气管起始部位，以2～3个软骨环为长度剪成气管环备用。将分离出的各组小鼠气管挂于恒温37 ℃的DMT L型微血管张力测定浴槽内，持续通O2，稳定40 min，以0.2 mN的步进给予预张力，直至预张力达到0.8 mN。待基线稳定后，连续2次给予60 mmol/L K+验证气管环活性(气管环收缩张力超过1.0 mN)，取收缩活性好的气管环管开始实验。采用累积加药法给予Mach(10-8～10-3mol/L)，观察Mach对气管环收缩反应的影响。

3.5组织学检查 实验结束后，取血完毕后处死小鼠，迅速打开胸腔暴露肺组织，分离右肺组织和右侧主支气管起始部位5～7个软骨环，用4 ℃ 0.9%氯化钠溶液漂洗干净，右肺和气管组织置于4%多聚甲醛内固定24 h以上，常规石蜡包埋，切片后进行苏木素-尹红(HE)染色、Masson染色和间苯二酚品红染色。

4 统计学处理

实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，运用SPSS 19.0 进行统计分析， Graphpad Prism 5.0进行作图，两组间比较采用最小显著性差异法(LSD法)。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 FlexiVent肺功能检测结果

DSP(3 mL/L) 连续滴鼻30 d可引起小鼠呼吸系统气道阻力(Rrs)增加，气道弹性阻力(Ers)增加，呼吸系统动态顺应性(Crs)降低，准静态弹性(Est)增加，准静态顺应性(Cst)降低，主气道阻力(P-3/8Rn)增加，组织衰减(P-3/8G)降低，组织弹性(P-3/8H)降低(P<0.05)，见图1。

Figure 1. The lung function test results of FlexiVent. Mean±SD.n=12.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图1 Flexivent肺功能检测结果

2 Myograph气管环张力检测法

Mach在10-8～10-3mol/L剂量范围内可引起各组小鼠气管环显著收缩，且呈浓度依赖。DSP 1.5和3 mL/L 连续滴鼻30 d可使Mach诱发的小鼠气管平滑肌收缩曲线显著左移，增加气管平滑肌对Mach的敏感性，且能显著增加Mach的最大收缩气管平滑肌的效应(P<0.01)；LPS 100 mg/L 连续滴鼻30 d可显著增加Mach的最大收缩气道的效应(P<0.01)，但不影响气道对Mach的敏感性，见图2。

Figure 2. The Myograph test results. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图2 Myograph气管环张力检测结果

3 组织学检查结果

各组小鼠右侧主支气管经HE、Masson和间苯二酚品红染色检查发现：LPS 100 mg/L滴鼻30 d处理小鼠支气管纤毛排列不整齐，气道上皮下呈明显纤维化,见图3(红色箭头处)；而DSP 3 mL/L滴鼻处理组小鼠的气道上皮下显著纤维化，胶原蛋白在气道基底膜下网状板沉积，网状板增厚，见图3(红色箭头处)。

各组小鼠右肺经HE、Masson和间苯二酚品红染色检查发现LPS 100 mg/L滴鼻30 d处理小鼠可见肺部支气管管腔变形，炎细胞浸润，肺泡壁肌纤维增多而胶原纤维增加不明显，见图4(红色箭头处)；而DSP 3 mL/L滴鼻处理小鼠的肺部支气管管腔严重变形，肺部可见大量炎细胞浸润，肺泡壁肌纤维和胶原纤维显著增加，见图4(红色箭头处)。

讨 论

COPD是一种以气流受限为特征的疾病，表现为气流受限不完全可逆性，并呈进行性变化，同时伴有主气道、肺及支气管对有害物质所致的慢性炎性反应增加。到目前为止COPD发生发展的确切原因并不清楚，一般认为吸烟及被动吸烟等烟雾暴露是目前公认的导致COPD发生的最重要危险因素。有研究表明长时间吸入香烟烟雾可引起呼吸道局部及肺实质发生炎症反应，使中性粒细胞、巨噬细胞、上皮细胞及活化的T淋巴积聚，同时局部炎症因子释放增多，引起局部的炎症反应增强[19]。目前常见COPD动物模型的复制是将实验动物暴露于香烟烟雾中[20]或用蛋白水解酶[21]、炎症刺激物(如LPS)[3]来诱导产生。这些造模方法要么造模时间长(香烟暴露至少6个月)、要么产生有创损伤导致动物死亡率增加，成模率低。经过总结前人的经验[14, 22-24]，本研究选用连续滴鼻30 d给予香烟尘雾颗粒的方式建立小鼠COPD肺功能损伤模型。

目前公认的评价COPD模型的方法主要有2个部分组成，一是观察肺及气管病理组织学，二是测定肺功能。2010年在意大利召开的COPD动物模型会议指出：COPD是以肺功能下降为特征的疾病，因此评价COPD模型的公认方法应以肺功能测定为主，同时采用病理学方法观察，将更有意义。FlexiVent采用强迫振荡法，给予呼吸系统一定的压力及流速刺激，观察该系统的反应，通过方程计算推导出呼吸系统的特性，一方面可检测呼吸系统的阻力(Rrs)、弹性(Ers)及顺应性(Crs)，另一方面可检测主气道阻力(P-3/8Rn)、组织衰减(P-3/8G)和弹性(P-3/8H)，还可检测肺的准静态顺应性(Cst)和弹性(Est)。小鼠肺功检测结果表明：Rrs、Ers增加，Crs下降，提示呼吸系统弹性阻力增加，肺顺应性减小，整个呼吸系统受损，引起阻塞性通气功能障碍；P-3/8Rn增加、P-3/8G和P-3/8H降低，提示气道阻力显著升高，气道受损；Est增加，Cst下降，提示组织抗衡压力的能力减弱，肺组织受损，且随DSP滴鼻浓度的增加，损伤程度增大；病理学检查显示DSP一方面可导致胶原蛋白在气道基底膜下网状板过量沉积，使网状板增厚，减少气道黏膜皱褶，导致气道阻力增加、气道狭窄加重，另一方面小鼠肺部有大量炎细胞浸润，支气管管腔严重变形，肺泡壁肌纤维和胶原纤维显著增加。另外，乙酰甲胆碱作为M胆碱受体激动剂，可直接作用于支气管平滑肌，引起支气管平滑肌收缩。本研究通过Myograph肌动描计系统进行的体外实验结果表明，DSP连续滴鼻30 d后Mach可诱发小鼠气管环收缩增强，气道平滑肌反应性增高。综上所述，香烟尘雾颗粒(DSP)滴鼻30 d的方法能够较好地建立同人类COPD疾病特点一致的小鼠模型。

Figure 3. The HE, Masson, Resorcinol fuchsin staining of mouse tracheas.

图3 小鼠气管HE、Masson和间苯二酚品红染色结果

Figure 4. The HE, Masson, Resorcinol fuchsin staining of mouse lungs.

图4 小鼠肺组织HE、Masson和间苯二酚品红染色结果