顶空气相色谱法同时测定环维黄杨星D中四种有机溶剂残留量的研究

江苏省盐城市食品药品监督检验中心（224055）郑灏 丁爱华 支荣荣

环维黄杨星D（Cyclovirobuxinum D, CVB-D）是从黄杨科植物小叶黄杨(Buxus microphylla Sieb. et Zucc. var. sinica Rehd. et Wils.)植物中提取的生物碱[1-4]，用作心血管疾病疗效良好的中药黄杨宁片的药用原料[5][6][7]，分别被2000年版、2005年版、2010年版和2015年版《中国药典》一部收载。环维黄杨星D在提取精制过程中涉及环己烷、丙酮、甲醇、三氯甲烷的使用，但四版药典中环维黄杨星D项下都没有规定有机溶剂残留检查项，为保证黄杨宁片的用药安全，有必要对环维黄杨星D中这几种有机溶剂的残留量进行测定。本研究参考有关文献[8-11]建立顶空毛细管气相色谱法（GC）测定环维黄杨星D中四种有机溶剂残留量的方法，方法准确、灵敏，可作为环维黄杨星D中残留溶剂的检测方法。

1 仪器与试药

Agilent 7890A气相色谱仪；Agilent DB-WAX色谱柱（30.0m ×0.32mm ×0.25μm）；Agilent 7694E 顶空进样器；梅特勒BP-211D电子分析天平；环已烷、丙酮、三氯甲烷、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）均为色谱纯；3批环维黄杨星D样品由东台市康宁植物素有限公司提供，批号分别为160701、160702、160703。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent DB-WAX 柱（30.0m ×0.32mm ×0.25μm），程序升温：40℃保持5 min，以10℃·min-1的速率升温至100℃，再以35℃·min-1程序升温至200℃，保持1分钟；进样口温度150℃；氢火焰离子化检测器( FID )温度220℃；载气为高纯氮气，流速为32.5 mL·min-1，分流比为10∶1；顶空进样器参数：平衡温度85℃，平衡时间30分钟，传输管温度为110℃，进样环温度为105℃。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取环己烷、丙酮、甲醇、三氯甲烷适量，加入DMF溶解并稀释制成每lmL中分别含环己烷0.388mg、丙酮0.5mg、甲醇0.5mg、三氯甲烷0.006mg的对照品混合溶液。精密量取3mL，置l0mL顶空进样瓶中，密封，气体进样。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品，研细，取约0.3g，精密称定，置10mL顶空进样瓶中，精密加入DMF 3mL，密封，气体进样。

2.3 系统适用性试验 精密量取“2.2.1”项下对照品溶液3mL、精密加入“2.2.1”项下对照品混合溶液2mL和DMF 1mL混合的供试品溶液以及DMF 3mL，分别置于顶空瓶中，迅速密封瓶口，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，色谱图见附图。其中环己烷、丙酮、甲醇、三氯甲烷的保留时间分别为1.604、2.191、3.913、6.293min，各对照品之间分离度均大于1.5，计算理论塔板数均大于10000。

从空白样品中可以看出DMF对测定无干扰。表明该法专属性良好。

2.4 检测限和定量限试验 分别精密称取环己烷、丙酮、甲醇、三氯甲烷各适量，用DMF定容并逐级稀释成适当浓度的测定溶液，分别精密量取各测定溶液3mL，置顶空瓶中，密封，按“2.1”项下色谱条件进行检测，并计算信噪比。当信噪比为10∶1时的测定浓度为定量限，此时环己烷浓度为0.154mg·L-1，丙酮浓度为0.807mg·L-1、甲醇浓度为4.006mg·L-1、三氯甲烷浓度为1.5mg·L-1。当信噪比为3∶1时的测定浓度为检测限，此时环己烷浓度为0.0463mg·L-1，丙酮浓度为0.202mg·L-1、甲醇浓度为1.502mg·L-1、三氯甲烷浓度为0.48mg·L-1。

附表1 重复性试验结果

附表2 加样回收率试验结果

附表3 三批样品溶剂残留量（%）

附图 对照品(A)、空白(B)和样品(C)色谱图。1.环己烷，2.丙酮，3.甲醇，4.三氯甲烷

2.5 线性关系考察 分别精密量取“2.2.1”项下对照品混合溶液0.4、0.6、1.0、1.4、1.6mL，置25mL量瓶中，用DMF溶液稀释至刻度，摇匀，即得。分别精密量取各浓度对照品溶液3mL置顶空瓶中，密封，气体进样。测定峰面积，以浓度为横坐标（X），峰面积的平均值为纵坐标（Y），进行线性回归。线性回归结果为：环己烷在168.947～275.789 mg·L-1范围内线性方程为Y = 6.000×106X+2.903×105(r=0.9845)，丙酮在210.835～843.341 mg·L-1范围内线性方程为Y=7.556×105X–2.576×102(r=0.9999)、甲醇在206.157～824.627 mg·L-1范围内线性方程为Y=2.206×105X+5.873×103(r=0.9999)、三氯甲烷在1.988～7.952mg·L-1范围内线性方程为Y=9.000×106X–1.281×102(r=0.9999)。

2.6 重复性试验 分别精密称取环己烷、丙酮、甲醇、三氯甲烷各适量，按“2.2.1”项下对照品溶液制备法平行制备5份，精密量取3mL，置顶空瓶中，密封，依法测定，计算其校正因子。见附表1。

2.7 精密度试验

2.7.1 日内精密度 同一天精密称取同一批样品(批号160701)，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备6份，分别按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算各残留溶剂的含量。测得日内精密度结果为：丙酮的平均含量为0.00093%，RSD为2.56%(n=6)，环己烷、甲醇及三氯甲烷未检出。

2.7.2 日间精密度 不同天精密称取同一批样品(批号160701)，共试验3天，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，分别按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算各残留溶剂的含量。测得日间精密度结果为：丙酮的平均含量为0.00092%，RSD为0.03% (n=6)，环己烷、甲醇及三氯甲烷未检出。

2.8 加样回收试验 取已测知各残留溶剂含量的样品(批号160701) 6份，每份精密称取0.3g，置顶空瓶中，精密加入“2.2.1”项下对照品混合溶液3mL使溶解，依法测定。将各加样回收溶液按“2.1”项下色谱条件进行测定，使用外标法定量。结果见附表2。

2.9 样品测定 取样品3批，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，气体进样，测定，按外标一点法计算残留量。结果见附表3。

3 讨论

根据《中国药典》2015年版四部附录0861项残留溶剂测定法规定[12]，环己烷、丙酮、甲醇、三氯甲烷限度应分别不得过0.388%、0.5%、0.5%、0.006%。测定结果表明，3批样品中溶剂残留均小于药典规定限度。本实验中四种溶剂的检测浓度和定量浓度均远低于药典规定，方法学验证证明该方法分离度良好，灵敏度高，在考察的浓度范围内线性关系良好，回收率符合规定，可作为环维黄杨星D中残留溶剂的质量控制方法。