氟比洛芬微生物计数方法适用性研究

北京市药品检验所 中药成分分析与生物评价北京市重点实验室（102206）江志杰 张光华

北京茗泽中和药物研究有限公司（102629）李斐菲 郭青苇

氟比洛芬又称苯氟布洛芬、氟联苯丙酸，是一种强效苯丙酸类解热抗炎镇痛药，能抑制前列腺素合成环氧合酶而起到止痛、抗炎及解热作用。它为白色或类白色结晶性粉末，在甲醇、乙醇、丙酮或乙醚中易溶，在乙腈中溶解，在水中几乎不溶[1]。它是一种新型的非甾体类镇痛抗炎药，品种有片剂、滴眼药、缓释胶囊剂等[2]。药品一旦受到微生物污染，将造成药品变质，主要成分分解而失效，也可能分解产生毒素，造成机体反应，引起疾病甚至威胁生命[3]，而原料的微生物污染情况直接影响到最终产品的质量。微生物检查作为药品安全性的重要指标[4]，微生物计数法用来测定原辅料或药品受污染的程度，评价产品的一般卫生质量及安全性[5]。按照《中国药典》2015年版四部通则1107非无菌药品微生物限度标准的规定，应对产品进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。中国药典2005年版开始引入微生物检查方法验证试验，通过方法适用性试验研究来考察其抑菌性的大小，制定适合产品的微生物学检查方法[7]，以保证选用方法准确、可靠。本文按照《中国药典》2015年版的操作要求及指导原则，对氟比洛芬微生物计数方法进行适用性研究，以确定适宜、有效的检查方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器设备 SPX-100B-Z生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；DNP-9082电热恒温培养箱（TAMATO科学株式会社）；XS1.DTXD-0.36脉动真空灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）；SW-CJ-1FD超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术公司）；JM-B2002电子天平(诸暨市超泽衡器设备有限公司)。

1.2 样品 氟比洛芬（批号分别为2131701、2131702、2131703），由永光制药有限公司生产。

1.3 试剂与培养基 蛋黄卵磷脂（批号：20180304）和组氨酸盐酸盐（批号：20180304）来源于北京奥博星生物技术有限责任公司；聚山梨酯80（批号：1306211）、磷酸氢二钾（批号：1405061）和磷酸二氢钾（批号：1303011）来源于西陇化工股份有限公司；pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：20171208）来源于青岛高科园海博生物技术有限公司；沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：20170123）、沙氏葡萄糖液体培养基（批号：20170711）、胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：20170920）和胰酪大豆胨液体培养基(批号：20170810)来源于青岛高科园海博生物技术有限公司，均在验证合格的灭菌程序下灭菌，培养基适用性试验均符合药典要求。

pH7.6无菌磷酸盐缓冲液：照中国药典2015年版通则8004配制，过滤，分装，灭菌。

缓冲液A：聚山梨脂80 30g、蛋黄卵磷脂3g、组氨酸盐酸盐1g、蛋白胨1g、氯化钠4.3g、磷酸二氢钾3.6g、磷酸氢二钠7.2g、纯化水1000ml，121度消毒15分钟。注意：先将蛋黄卵磷脂加到聚山梨酯80中，研磨，混合，然后加入培养基或是混合液体中，煮沸，待完全溶解后分装，消完毒后，带厚手套，将底下的沉淀慢慢摇均匀，也可以放置一周后，摇匀使用。

1.4 菌种 金黄色葡萄球菌 [CMCC (B)26003]、铜绿假单胞菌 [CMCC (B)10104]、大肠埃希菌 [CMCC(B)44102]、白色念珠菌 [CMCC(F)98001]、黑曲霉 [CMCC(F)98003]均购自中国食品药品检定研究院，菌株传代数均为第3代。

1.5 试验环境 符合《中国药典》2015年版的要求，在环境洁净度D级下的局部洁净度B级的单向流空气区域内进行；微生物限度室、洁净工作台及生物安全柜洁净度经监测符合相关要求；每次试验洁净工作台沉降菌监测记录均符合规定。

2 方法

2.1 菌液的制备 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的新鲜培养物至10ml胰酪胨大豆肉汤培养基中，33℃培养24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml沙氏葡萄糖液体培养基中，23℃培养24h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。

附表1 不同方法的预实验结果

附表2 氟比洛芬微生物计数方法适用性回收比值

附表3 中和剂对照组的回收比值

接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，25℃培养7d，加入3ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。过滤菌丝吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬液。

2.2 微生物计数法用供试液的制备 供试液①：取本品5g，加含3%聚山梨脂80 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至1000ml，振摇至供试品分散均匀，制成1∶200的供试液。

供试液②：取本品5g，加含3%聚山梨脂80 pH7.6无菌磷酸盐缓冲液至1000ml，振摇至供试品分散均匀，制成1∶200的供试液。

供试液③：取本品5g，加缓冲液A至1000ml，振摇至供试品分散均匀，制成1∶200的供试液。

2.3 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验

2.3.1 菌液对照组 方法1、方法2、方法4和5：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml，加入制备好的试验菌液0.1ml（细菌、酵母菌小于1000cfu，霉菌小于600cfu），混匀，使每1ml稀释液中含菌量小于100cfu，分别取此菌液1ml注皿，测定其每毫升的活菌数，结果为 A。方法3：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液20ml，加入制备好的试验菌液0.1ml（细菌、酵母菌小于1000cfu，霉菌小于600cfu），混匀，使每2ml稀释液中含菌量小于100cfu，分别取此菌液2ml注皿，测定其每毫升的活菌数，结果为A。

2.3.2 供试品对照组 方法1、方法2、方法4和5：分别取取供试液①、供试液②、供试液③10ml，加入稀释液0.1ml，取1ml注皿，分别测定供试品本底的需氧菌总数和霉菌和酵母菌总数，测定结果为B。方法3：取供试液③20ml，加入稀释液0.1ml，取2ml注皿，分别测定供试品本底的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，测定结果为B。

2.3.3 试验组 方法1、方法2、方法4和5：取供试液①、供试液②、供试液③10ml各五只试管，分别加入制备好金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌和黑曲霉试验菌菌悬液0.1ml，混匀，取1ml注皿，测定需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，测定结果为C。方法3：取供试液③20ml各五只试管，分别加入制备好金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌和黑曲霉试验菌菌悬液0.1ml，混匀，取2ml注皿，测定需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，测定结果为C。

2.3.4 中和剂对照组 方法5：取供试液③10ml各五只试管，分别加入制备好金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌和黑曲霉试验菌菌悬液0.1ml，混匀，取1ml注皿，测定需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，测定结果为D。上述所加菌液的体积均未不超过供试液体积的1%。已注入供试液的平皿，细菌计数倾注胰酪胨大豆琼脂培养基，而方法5是倾注含3%聚山梨酯80、0.3%卵磷脂的胰酪胨大豆琼脂培养基，待凝固后，置33℃培养3d，逐日观察结果；霉菌和酵母菌计数倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，待凝固后，置25℃培养5d，逐日观察结果。

2.3.5 比值计算 试验菌的比值=(菌落数C-菌落数B)/菌落数A；中和剂对照组的比值=菌落数D/菌落数A。

3 结果与分析

3.1 微生物计数方法适用性预实验结果 从附表1预实验结果可以看出，方法1中的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉的回收率均为0，说明氟比洛芬的抑菌作用很强，通过分析发现，供试液①pH值为6.0左右，偏酸性，因此后面的试验均采用了碱性的磷酸缓冲液作为稀释液，考虑到样品为非水溶性的粉末状，为了分散均匀，稀释液中添加了一定量的聚山梨酯80；方法2中的铜绿假单胞菌的回收率为0.2，方法3中的金黄色葡萄球菌的回收率为0，可能是供试液量增加导致的，均不符合药典要求；方法4结果显示，除铜绿假单胞菌的回收比值为0.4，其余试验菌株的回收比值均大于0.5，因此考虑在培养基中添加一定量的卵磷脂和聚山梨酯80。

3.2 微生物计数方法适用性结果 氟比洛芬的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数采用平皿法进行方法适用性试验结果见附表2。在3次独立的需氧菌计数方法平行试验中，金黄色葡萄球菌的回收比值分别为1.1、0.9、0.7，枯草芽孢杆菌的回收比值分别为0.6、1.0、0.8，铜绿假单胞菌的回收比值分别为1.0、1.0、0.9，黑曲霉的回收比值分别为0.8、1.0、0.9，白色念珠菌的回收比值分别为0.9、1.0、1.3，5株需氧菌的回收比值均符合药典规定，因此，可照此方法测定氟比洛芬的需氧菌总数。在3次独立的霉菌和酵母菌计数方法平行试验中，黑曲霉的回收比值分别为0.7、0.9、0.8，白色念珠菌的回收比值分别为0.7、0.9、1.1，2株真菌的回收比值均符合药典规定，因此，可照此方法测定氟比洛芬的霉菌和酵母菌总数。

3.3 中和剂对微生物有无毒性结果 为考察缓冲液A和培养基中添加一定量的卵磷脂和聚山梨酯80对微生物有无毒性，设置了中和剂对照组，从附表3中的结果来看，中和剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数比值均在0.8～1.5之间，符合药典要求的0.5～2.0范围内。

4 讨论

随着《中国药典》2015年版的实施，对原料及辅料的微生物限度控制也越来越严格[6]。而原料的微生物检验方法适用性验证也应符合《中国药典》2015年版四部[7]通则1106的要求，若回收比值为0.5～2.0，方法可用于样品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数检查。产品存在抑菌性时，中国药典2015年版强调的方法学适用性试验更显重要性，只有采用适宜方法去除抑菌活性，才有可能检出药品中污染的微生物，避免检验结果假阴性，从而保证微生物限度检查方法的科学性，以有效控制药品质量[8]。已有许多文献报道，通过各种手段消除供试品的抑菌作用，找到合理的科学的检测方法。平皿法是非无菌制剂微生物计数的传统方法，具有简单方便，成本低，结果准确的优点，是优先考虑的方法[4]。预实验发现氟比洛芬的抑菌性比较强，而薄膜过滤法能直接彻底消除抑菌作用、计数结果准确度高，但是不适用于非完全溶解的供试品。Tween-80 和卵磷脂常作为季铵化合物、对羟基苯甲酸等化合物的中和剂，可能会保护微生物细胞膜起到中和作用。聚山梨酯80是一种表面活性剂，可作为乳化剂和中和剂等，用于药品的微生物限度检查时供试液的制备，使供试液分散系统更具相容性。因此，选用卵磷脂和聚山梨酯80作为中和剂，采用培养基稀释法，最低稀释级取1∶200的供试液1ml 注皿，才可以消除其抑菌作用。最终确定的方法为：取本品10g，加缓冲液A至2000ml，振摇至供试品分散均匀，制成1∶200的供试液。需氧菌总数测定，取1∶200的供试液1ml，注皿，平行2份，注入3%聚山梨酯80和0.3%蛋黄卵磷脂的胰酪大豆琼脂培养基，依法检查（中国药典2015年版通则1105平皿法）；霉菌和酵母菌总数测定，取1∶200的供试液1ml，注皿，平行20份，依法检查（中国药典2015年版通则1105平皿法）。