维甲酸相关孤儿核受体C可通过抑制糖酵解来调节宫颈癌细胞增殖

陈 玮， 王 静， 董 曦

复旦大学附属中山医院生殖医学中心，上海 200032

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，是仅次于乳腺癌的第二大常见的女性肿瘤，是女性癌症发病和死亡的第四大主要原因[1-3]。该病每年新发病例约50万例，且呈每年0.6%的上升趋势，平均死亡年龄为55岁[4]。宫颈癌转移导致约90%患者死亡[5]。手术联合以顺铂为主的化疗是宫颈癌的主要治疗方法。约1/3的宫颈癌患者经历了复发，且复发大多发生在治疗结束后2年内[5]。

肿瘤细胞获取能量主要依赖于糖酵解途径[6]。此途径能为细胞增殖、转移等过程高效、快速地提供能量[7]，能够满足肿瘤细胞快速增长对能量的需要，并在竞争能量时比正常细胞更占优势[6]。维甲酸相关孤儿核受体C(RORC/RORγ)是维甲酸相关孤儿核受体家族成员之一，在一些肿瘤发生发展中发挥重要的调控作用[8-10]。但RORC在人宫颈癌细胞中的表达和功能还未被深入研究。缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)已被证实在人体多种实体性肿瘤的生长、转移、血管形成等过程中具有关键的调控作用[11-13]。其中，HIF-1α是主要的促进糖酵解的转录因子[14-15]。因此，本研究将重点探讨RORC在宫颈癌肿瘤细胞代谢中的调控作用，揭示RORC能否通过调控HIF-1α表达转录来影响宫颈癌细胞糖代谢，进而抑制宫颈癌细胞增殖。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要检测试剂 人宫颈癌细胞系购自中国科学院上海生命科学学院细胞库。细胞培养所需试剂(DMEM培养基、胰酶、血清和PBS缓冲液等)购自Gibco公司(美国)[16]。细胞增殖检测试剂盒购自Dojindo Molecular Technologies公司(日本)[16]。糖代谢检测试剂盒购自Biovision公司(美国)[16]。本研究中所使用的抗体购自ProteinTech生物公司(中国)[16]。

1.2 细胞培养 Siha和HeLa细胞培养于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中，使用0.25%胰蛋白酶消化传代。处于对数生长期的细胞可用于后续各项实验研究。

1.3 RORC过表达细胞构建 RORC过表达慢病毒购于汉尹生物科技(上海)有限公司。将Siha和HeLa细胞接种于6 cm培养皿中，其密度为60%～70%时，每个培养皿细胞用50 μL病毒感染24～48 h，随后使用嘌呤霉素(2.5 μmol/L)进行筛选，并使用免疫印迹方法进行验证。

1.4 CCK-8细胞增殖实验 将构建好的RORC过表达细胞及其对照细胞，计数稀释至50 000个/mL，接种于96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，设置3个复孔，置于培养箱中培养，每隔24 h测定光密度值(450 nm)，连续测定5 d。本实验需重复3次以上，最终根据测定结果绘制细胞增殖曲线。

1.5 葡萄糖代谢检测 取3×104个细胞置于70 μL培养基中，分装于96孔板中，在细胞培养箱过夜培养，随后按照糖代谢检测试剂盒说明书测定其相应的细胞葡萄糖摄取水平。

1.6 Western 印迹检测 收集RORC过表达宫颈癌细胞及对照组宫颈癌细胞沉淀，制备成3 μg/μL的蛋白液，利用SDS-PAGE电泳进行检测，使用8%的脱脂牛奶封闭1 h，一抗4℃温育12 h以上，二抗室温温育2 h以上，利用化学发光法进行目的蛋白条带检测。

1.7 启动子活性检测 利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测HIF-1α启动子活性，其操作过程参照以往研究[16]。

2 结 果

2.1 RORC在宫颈癌细胞中的表达水平和对宫颈癌细胞增殖的影响 Western印迹结果(图1A)显示：RORC过表达宫颈癌细胞中RORC蛋白表达水平明显升高。CCK-8检测结果(图1B)表明：RORC表达增强后能够抑制宫颈癌细胞Siha和HeLa的增殖(P<0.05)。

2.2 RORC对宫颈癌细胞糖代谢水平的影响 使用糖代谢检测试剂盒检测RORC过表达细胞系，结果(图2)发现，RORC表达上调后可以抑制宫颈癌细胞葡萄糖摄取水平和乳酸生成水平(P<0.05)。

图1 过表达RORC对宫颈癌细胞增殖的影响

2.3 HIF-1α可能是RORC潜在的作用靶点 免疫印迹检测(图3A)发现，RORC表达增强后，可以明显抑制宫颈癌细胞内HIF-1α、GLUT1和LDHA蛋白的表达水平(P<0.05)。报告基因检测(图3B)进一步发现，RORC可以抑制HIF-1α启动子活性，表明RORC可能通过抑制HIF-1α转录来调节其下游靶基因的表达(P<0.01)，进而影响宫颈癌细胞糖代谢以及增殖过程。

图2 过表达RORC对宫颈癌糖代谢摄取与乳酸生成水平的影响

图3 RORC对糖代谢相关基因表达(A)及HIF-1α(B)启动子活性的影响

3 讨 论

RORC对肿瘤细胞的增殖抑制作用在乳腺癌、黑素瘤和前列腺癌等多种肿瘤中有报道。RORC在乳腺癌中主要通过与蛋白质精氨酸甲基转移酶2(PRMT2)相互作用，影响DNA损伤修复[9]；RORC在前列腺癌中通过作用于PD-L1/ITGB6/STAT3通路影响肿瘤细胞糖酵解[16]等机制抑制肿瘤细胞增殖。本研究结果表明，RORC能抑制宫颈癌细胞的增殖。

本研究证明，RORC可通过抑制HIF-1α的表达及活性来降低宫颈癌细胞糖代谢水平，从而抑制细胞增殖。以往研究[17]发现，HIF-1α在多种肿瘤中呈高表达状态，在调节糖酵解过程中发挥着重要的转录调控作用。HIF-1α活性被抑制后，肿瘤细胞生长速度明显放缓[18]；进一步研究[19]发现，一些重要的糖酵解限速酶如GLUT1、LDHA、己糖激酶(HK)等的转录均受HIF-1α调控，进而影响肿瘤糖代谢及增殖。另外，HIF-1α还可以与其他转录因子(如c-Myc)协同调控糖代谢限速酶转录表达[20-21]。本研究发现，RORC能够有效抑制HIF-1α、GLUT1、LDHA的表达及HIF-1α启动子的活性，进一步印证了RORC通过影响糖酵解，使得细胞快速增殖所需的能量供给不足，从而抑制宫颈癌细胞增殖。

综上所述，本研究发现RORC在转录水平调控HIF-1α的转录表达，进而减少GLUT1和 LDHA的表达，降低宫颈癌细胞糖酵解水平，达到抑制其增殖的目的。