胃癌组织C19orf28蛋白表达的预后价值

高其忠， 高 翔， 刘 芬， 葛晓松*

1. 江南大学附属医院胃肠外科，无锡 214062 2. 江南大学附属医院肿瘤内科，无锡 214062 3. 江南大学附属医院肿瘤研究所，无锡 214062

胃癌(gastric cancer，GC)是消化系统高发肿瘤之一，其发病率和死亡率已分别跃居癌症相关第4位和第2位[1]。我国每年新增近68万GC患者[2-3]，约占全世界GC新发病例的一半；同时，我国每年大约49.8万人死于GC。GC患者5年存活率非常低[4-6]，超过80%的病例在诊断时已是晚期[7-8]。尽管我国GC患者年龄标准化的死亡率近年来降低[9]，但是其仍然严重威害患者的生活质量，给家庭和社会带来沉重负担。因此，亟需阐明GC的发病机制，寻找可以诊断GC恶性肿瘤的标志分子和预测患者存活的预后预测因子。

C19orf28也称PP3501、MFSD12，是新近发现的一种肿瘤相关基因[10]。目前，关于C19orf28蛋白表达与GC预后和生存的相关性鲜见报道。本文拟通过免疫组化(IHC)方法，探讨C19orf28是否可以作为GC患者预后的独立预测因子。

1 资料与方法

1.1 标本来源 纳入2013-12-31至2014-12-30在江南大学附属医院(无锡市第四人民院)进行根治性手术的141例GC石蜡样本及其癌旁组织样本(距癌组织5 cm)。141例患者中，男性112例，女性29例；年龄34～84岁，平均年龄65岁；高/中分化腺癌32例，中低/低分化腺癌109例；TNM Ⅰ～Ⅱ期25例、Ⅲ～Ⅳ期116例，N049例、N1～392例。患者纳入标准：(1)原发灶标本为GC，所有标本术后均经2名病理医师复核证实；(2)术前未接受放、化疗；(3)有完整的临床、病理和随访资料；(4)死亡原因仅为肿瘤复发或转移。本研究经江南大学附属医院(无锡市第四人民院)医学伦理委员会同意；患者知情同意并填写知情同意书。

1.2 实验材料 C19orf28多克隆抗体(Cat：bs-9680R，北京博奥森生物技术有限公司)，组织芯片空白蜡块(UNITMA Quick-Ray UB06-1, 韩国)，GTVesionTM Ⅲ 抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒[GK500705，基因科技(上海)股份有限公司]。

1.3 免疫组化检测结肠癌组织中C19orf28蛋白表达 采用细针打孔方法，分别选取141例胃癌组织及癌旁组织蜡块中的1 mm圆柱形癌组织或者癌旁组织，制备组织芯片蜡块。切片并转移到免疫组化专用载玻片上制成组织芯片。IHC染色步骤如下：常规脱蜡水化；0.01 mol/L柠檬酸纳缓冲液(pH 6.0)进行热修复10 min；3%双氧水室温孵育15 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性；滴加C19orf28多克隆抗体(1∶600)，4℃过夜，PBS冲洗3次，每次3 min；滴加A液，室温孵育30 min，PBS冲洗；滴加新鲜配制的DAB工作液，室温孵育5～10 min；苏木精复染；无水乙醇脱水封片。以PBS液替代一抗或二抗作为阴性对照。

1.4 染色结果判断 C19orf28阳性定位于细胞质，其表达按染色强度评为：无(0分)、弱(1分)、中(2分)和强(3分)；按阳性细胞比例评为：<1%(1分)、1%～10%(1分)、10%～33%(3分)、33%～67%(4分)，>67%(5分)。总体评分值=染色强度+阳性细胞比例评分，评分：≤2分为低表达；>2分为高表达。结果由病理科2位医师独立双盲读片评定。

1.5 随 访 对全部患者进行术后定期随访，记录其完整的临床相关资料，随访截止日期为2018年10月31日。

1.6 统计学处理 采用SPSS 16.0进行分析，计数资料采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier方法分析，影响生存的多因素分析采用Cox回归方法。检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 C19orf28在GC组织中的表达 IHC结果(图1)显示：所测GC组织均C19orf28蛋白阳性(阳性率为100%)，癌旁组织均未检测到C19orf28蛋白；GC组织C19orf28阳性评分为(1.972±0.675)分，与癌旁组织差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 C19orf28在胃癌组织中的表达

A：GC组织C19orf28 染色强；B: GC组织及癌旁组织IHC评分比较. Original magnification: ×400；**P<0.01

2.2 GC组织C19orf28表达与患者临床病理特征的关系 结果(表1)发现：C19orf28低表达患者(N=98)与C19orf28高表达患者(N=43)性别、神经和(或)脉管侵犯、TNM分期、人类表皮生长因子受体2(HER2)表达、肿瘤分化程度、肿瘤细胞增殖状态(Ki67)等差异均无统计学意义。

表1 C19orf28表达与患者临床病理特征的相关性

HER2:人类表皮生长因子受体2

2.3 不同C19orf28表达患者的生存分析 结果(图2)显示：C19orf28高表达患者OS短于C19orf28低表达患者，差异有统计学意义(P=0.000 3)。C19orf28蛋白高表达患者平均生存期(23.40个月)短于C19orf28低表达患者平均生存期(38.35个月)，差异有统计学意义(P<0.01)。

图2 C19orf28高表达患者与低表达患者的Kaplan-Meier生存曲线

2.4 Cox风险回归模型分析GC患者的生存危险因素 Cox风险回归模型分析结果(表2)显示：C19orf28表达、局部浸润、淋巴结转移、M分期、神经和(或)脉管侵犯与GC患者预后相关(P<0.05)；C19orf28表达(HR=2.34, 95% CI 1.30～4.21,P=0.005)是GC患者预后的独立预测因子。

表2 Cox风险回归模型生存分析

3 讨 论

C19orf28是一种多次跨膜蛋白，属于主要的促进子超家族(the major facilitator superfamily，MFS)。MFS超家族是生物圈中发现的最大的二级载体超家族[11]，对营养吸收和肾脏清除过程中化合物穿过生物膜起重要作用。编码C19orf28蛋白的基因位于19号染色体；由于可变剪接事件，C19orf28蛋白有两种蛋白亚型。19号染色体全长大约6 300万个碱基，包括1 400多个基因，约占人类基因组DNA的2%。19号染色体具有人染色体的最大基因密度，是多种免疫球蛋白超家族成员的遗传家园，包括杀伤细胞和白细胞Ig样受体、细胞间黏附分子(ICAMs)、癌胚抗原相关的细胞黏附分子(CEACAM)和妊娠特异性糖蛋白家族(PSG)以及Fc受体等。眼睛颜色和头发颜色、肤色的关键基因也位于19号染色体。C19orf28与欧亚大陆人色素沉着、非洲人色素沉着相关[12-13]，以及与马的蘑菇毛色[14]、小鼠的灰色毛色[12]和狗的白色毛色[15]有关。

近来研究发现C19orf28具有癌基因功能。Wei等[10]发现，黑素瘤中异常表达的C19orf28通过激活PI3K信号通路促进细胞周期进程，促进细胞增殖、侵袭和转移；高表达C19orf28是黑素瘤患者OS和DFS的独立预后因素。Wang等[16]也证明，丁酸钠处理神经母细胞瘤细胞后显著诱导pp3501 (C19orf28)上调，而pp3501 (C19orf28)抑制神经母细胞瘤细胞增殖，使细胞周期停滞于G1期。然而，C19orf28是否在胃癌中扮演重要角色目前还不确定。

本研究首次通过IHC方法证明C19orf28与GC患者预后显著相关。C19orf28蛋白在GC癌组织中高表达(阳性率为100%)。尽管C19orf28蛋白高表达患者与C19orf28低表达患者的临床病理特征不存在有意义的统计学差异，但是，C19orf28高表达患者OS显著短于C19orf28低表达患者OS(P=0.000 3)；C19orf28高表达患者平均生存期(23.40个月)显著短于C19orf28低表达患者平均生存期(38.35个月，P<0.01)。Cox风险回归模型显示，C19orf28表达是GC患者预后的独立预测因子。因此，C19orf28蛋白表达在预测GC患者预后中有一定的应用价值。

综上所述，本研究通过IHC方法检测GC组织及癌旁组织中C19orf28蛋白的表达，并结合患者临床病理特征及随访患者预后情况，证实了高表达C19orf28可能是GC患者不良预后的独立预测因子。