探究南美蟛蜞菊不同器官浸提液对小球藻的化感作用*

郑耀贤 ［北京师范大学（珠海）附属高级中学 广东珠海 519080］

小球藻（Chlorellasp.）是一类普生性单细胞绿藻，属于绿藻门、绿藻纲、小球藻属。小球藻具有生态分布广，易于培养，生长速度快等优点，是进行生物技术研究和环境科学研究的好材料［1］。著名的卡尔文循环就是以小球藻为实验材料，揭示了二氧化碳中的碳在光合作用中转化为有机碳的途径。

南美蟛蜞菊（Wedelia trilobata）为菊科蟛蜞菊属植物，广泛分布于我国华南地区及沿海部分地区，是当地危害严重的区域性入侵植物之一［2］。南美蟛蜞菊一般生长在道路、水沟、农田边沿和湿润草地等处,农民在清除田埂杂草时，常将其踩入水田中作为有机肥，或作为旱地作物的覆盖绿肥，结果发现这种肥料对作物有很强的化感作用［3］，常导致作物长势变差、产量降低等不良症状。

化感作用（allelopathy）是指植物通过向环境释放特定的次生物质从而对邻近其他植物（含微生物及其自身）生长发育产生的有益和有害的影响［4］。富营养化水体中藻类大量繁殖，利用植物间的化感作用抑制藻类生长的研究是环境生物学研究的热点之一［5］。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料 恒温干燥箱、恒温光照培养箱、电子天平、恒温水浴锅、冰箱、显微镜、血球计数板、移液枪、广口瓶、锥形瓶、封口膜、纱布、滤纸、蒸馏水等。

1.2 藻种及培养 实验所用藻种从校内池塘采集后经微生物纯化培养所得，采用BG-11培养基进行培养，其组成为（L）：NaNO31.5g、K2HPO40.04g、MgSO4·7H2O 0.075g、CaCl2·7H2O 0.036g、Na2CO30.02g、柠檬酸0.006g、柠檬酸铁0.006g*微量元素溶液A51mL、氨苄青霉素（终浓度）50μg/mL、蒸馏水1000mL。［*微量元素溶液A5：H3BO42.86g、MnCl2·4H2O 1.81g、ZnSO40.222g、Na2MoO40.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co（NO3）2·6H2O 49.4g］

培养条件为（25±1）℃、光照强度为5000lx、连续光照。

1.3 南美蟛蜞菊根、茎、叶浸提液母液的制取南美蟛蜞菊洗净自然风干后将根、茎、叶分离，分别剪碎，80℃干燥48h，得到根、茎、叶干品，各称取1g 干品，研磨后分别加入40mL 蒸馏水，100℃水浴加热30min，过滤定容至50mL，作为实验母液，其相对浓度都为20g/L，置于广口瓶，低温保存。对照组不添加母液，每个处理重复3次［6］。

1.4 测量方法

小球藻细胞密度： 用血球计数板在光学显微镜（10×10）下计数。

小球藻细胞抑制率：南美蟛蜞菊根、茎、叶浸提液对小球藻的抑制率计算公式如下［7］：

［IR 为小球藻细胞抑制率（%）；N 为处理组细胞密度；N0为对照组细胞密度］

2 实验步骤

1）取处于对数生长期的小球藻60mL，均分为3份，A、B、C 份各20mL。

2）将A 份小球藻平分为4份分别加入到4个100mL 锥形瓶中，标为A1、A2、A3、A4，再将根浸提液母液（0mL、1.25mL、2.5mL、5mL）分别加入A1～A4中；将B 份小球藻平分为4份分别加入到4个100mL 锥形瓶中，标为B1、B2、B3、B4，再将茎浸提液母液（0mL、1.25mL、2.5mL、5mL）分别加入B1～B4中；将C 份小球藻平分为4份分别加入到4个100mL 锥形瓶中，标为C1、C2、C3、C4，再将叶浸提液母液（0mL、1.25mL、2.5mL、5mL）分别加入C1～C4中。最后分别加入BG-11培养基使培养体系总体积均为50mL。用植物材料的质量表示化感物质的含量（g/L），分别得到南美蟛蜞菊根、茎、叶浓度梯度为0g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L 的化感培养液。

3）将3组共12个培养体系放到恒温光照培养箱中进行连续光照培养。每隔12h 摇荡一次，连续培养7d，每天定时用血球计数板进行小球藻细胞密度显微计数，记录。

4）进行3次重复，采用Excel 整理数据，Origin6.5画曲线。

3 结果与分析

3.1 南美蟛蜞菊根浸提液对小球藻种群密度的影响 南美蟛蜞菊根浸提液对小球藻种群密度的化感抑制作用比较明显。如图1-B，对照组的小球藻种群数量呈“S”型曲线增长，是典型的逻辑斯蒂增长模型，培养到第7天种群数量达到最大值且基本稳定。不同浓度的根浸提液处理后小球藻的增长曲线均出现明显的变形，其中1g/L 和2g/L的处理组种群密度变化曲线接近重叠，且种群数量均出现下降，这说明1g/L 以上浓度的根浸提液小球藻种群数量有明显的抑制作用。由图1-A，可知不同浓度的根浸提液对小球藻的抑制率随时间不断提高，1g/L 和2g/L 的处理组培养的第7天其抑制率均达到接近80%，其半效应浓度（EC50）出现在第4天。综合分析，高于1g/L 的根浸提液对小球藻有明显的抑制效果。

图1 南美蟛蜞菊根浸提液对小球藻种群密度的影响

3.2 南美蟛蜞菊茎浸提液对小球藻种群密度的影响 南美蟛蜞菊茎浸提液对小球藻种群密度也有明显的抑制的作用。如图2-B，0.5g/L 和1g/L的茎浸提液处理小球藻，小球藻种群密度随时间依然接近“S”型的增长曲线，其抑制率都接近30%（如图2-A），说明低浓度的茎浸提液对小球藻种群数量增长有一定的干扰。但进一步研究发现，在培养3天后，0.5g/L 茎浸提液对小球藻的抑制效果比1g/L 的效果略好，这与孔见凡［8］发现南美蟛蜞菊干茎浸提物对油菜种子萌发有明显的抑制作用，并且随着浓度的增高抑制作用减弱（0～1500mg/L）的结果一致。说明较低浓度茎浸提液对小球藻的抑制效应可能存在不同于叶和根的效应，但其机理尚不清晰，后续实验建议可以进一步探究0.5g/L 前后的茎浸提液的抑制效果。2g/L 的茎浸提液对小球藻种群密度有显著的抑制效果，其种群密度随时间变化几乎不增长，其抑制率高达60%，其半效应浓度（EC50）出现在第3～4天。

由图1和图2综合分析认为，南美蟛蜞菊茎浸提液对小球藻的抑制作用也比较明显，但不及根浸提液的抑制效果。若以茎为材料，建议使用2g/L 的茎浸提液处理小球藻。

图2 南美蟛蜞菊茎浸提液对小球藻种群密度的影响

3.3 南美蟛蜞菊叶浸提液对小球藻种群密度的影响 南美蟛蜞菊叶浸提液在受试浓度范围内对小球藻种群密度的抑制效果不是很明显。如图3-B，0.5g/L 和1g/L 的叶浸提液处理小球藻，与对照组的增长曲线几乎重叠，都呈典型“S”型增长曲线，其中，在培养的前段时间甚至出现一定的促进作用，其促进率在5%左右（图3-A）。2g/L 的叶浸提液对小球藻种群密度有一定的抑制作用，其抑制率最高可达45%，达不到半效应浓度（EC50），说明2g/L 的叶浸提液对小球藻不会造成明显的抑制效果，后期建议增大叶浸提液的浓度进行进一步的探究。

图3 南美蟛蜞菊叶浸提液对小球藻种群密度的影响

4 结论与讨论

南美蟛蜞菊的根、茎浸提液对小球藻的种群密度均有明显的抑制效果，其中根浸提液的抑制效果好于茎浸提液，1g/L 根浸提液对小球藻的抑制率高达80%。叶浸提液在受试范围内对小球藻的种群密度的抑制效果不明显，低浓度的叶浸提液对小球藻种群密度还有一定的促进作用。

本研究采用小球藻作为实验材料，开展基于生态环境研究的综合实践探究活动，有利于发展学生的综合能力，落实新课程标准“科学、技术、社会相互关系的教育”的教学建议，发展学生的创新精神和实践能力。

开展基于项目的综合实践探究活动，学生在掌握基本技能的同时，尝试运用种间关系的视角解决生态环境中的实际问题，极大提升了学生探究学习的兴趣。这种基于科学大概念的学习，学生能感受到知识技能的切实意义，是指导学生开展真正学习的有效途径，培养创新性人才的基础。