利用PCR技术鉴定河豚鱼的探索

江瑞宁 万苾馨 苏新华 窦向梅

（北京市十一学校 北京 100039）

河豚鱼是我国沿海地区的传统美食，但是部分河豚鱼有剧毒，食用后会引起中毒甚至死亡［1］。我国水产品管理办法规定禁止销售野生捕捞的河豚鱼。但是我国沿海地区河豚鱼资源丰富，大量捕捞的河豚鱼通过各种非法途径混入市场，例如将野生捕捞的河豚鱼去除头和皮，作为其他的鱼种销售，或将河豚鱼制成烤鱼片等各种鱼类制品，进入市场销售。这些去除形态学特征的河豚鱼，使消费者无法辨认，致使部分消费者误食有毒河豚鱼，从而引起中毒甚至死亡。据不完全统计，2005—2016年间在我国福建、上海、浙江、山东、江苏等地即发生了8起因食用烤鱼片引起的TTX 中毒事件，造成14人中毒、5人死亡，死亡率高达36%，严重危害消费者的健康和生命安全。

传统的河豚鱼鉴定主要依赖鱼类样品外部的形态特征，不适用于鱼类制品中河豚鱼成分的鉴定。本研究利用PCR 技术，扩增河豚鱼特定靶基因DNA 片段，实现鱼类制品中河豚鱼成分的鉴定，防止消费者误食含有河豚鱼成分的鱼类样品，保护消费者身体健康。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 河豚鱼样品由福建水产研究院提供，并经过专家鉴定。烤鱼片样品采自北京超市。

1.1.2 仪器与试剂 凝胶成像仪（美国Bio-Rad）、DNA 电泳仪（北京市六一仪器厂）、基因扩增仪（美国MJ Research）、高速离心机（德国Eppendorf）、微量可调移液器（德国Brand）、涡旋振荡器（德国IKA）、电子天平（瑞士Mettler）、微量核酸分析仪（美国NANO200）。

海洋动物组织基因组DNA 提取试剂盒、TAE缓冲液（50×TAE Buffer）、100bp DNA ladder、dNTP Mixture(10mM each)、Gene Red 核酸染料均购自天根生化公司；PCR Nucleotide Mix 和GoTaq Flexi DNA Polymerase 购自Promega 公司。

1.1.3 引物［2］：引物由北京英骏生物技术有限公司合成。

上游引物：5′－CCT ATG GCG TGA AAA ACC AC－3′

下游引物：5′－ACA AGA CCG ACG CTC TGA AT－3′

1.2 方法

1.2.1 河豚鱼基因组DNA 提取 按照海洋动物组织基因组DNA 提取试剂盒（DP324）说明书提取DNA。100μL TE 洗脱DNA，-20℃保存。

1.2.2 PCR 反应体系的优化

1）退火温度对PCR 反应结果的影响。采用温度梯度PCR 反应，选择PCR 反应的最佳退火温度。温度范围设定为42～68℃之间。PCR 反应体系的配制见表1。PCR 反应参数见表2。

表1 PCR 检测的反应体系

表2 PCR 检测反应参数

2）镁离子浓度对PCR 反应结果的影响。在确定了最佳退火温度后，改变PCR 反应体系（表1）中镁离子的浓度，使镁离子的终浓度分别为0mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L、3.5mmol/L、4.0mmol/L、4.5mmol/L、5.0mmol/L、5.5mmol/L，分别做PCR 反应，确定最佳镁离子的浓度。

3）DNA 模板对PCR 反应结果的影响。在确定了最佳退火温度和最佳镁离子浓度后，改变PCR反应体系（表1）中DNA 模板浓度，依次加入DNA模板量分别为0μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、1.0μg 和1.1μg，确定最佳的模板DNA 加入量。

1.2.3 河豚鱼成分PCR 鉴定方法与其他鱼种的交叉反应 提取市场上常见水产品鲤鱼、鲫鱼和草鱼的DNA，使用河豚鱼PCR 鉴定方法进行检测，观察河豚鱼特异性引物是否与这些鱼种有交叉反应。

1.2.4 烤鱼片样品中河豚鱼成分检测 检测从市场采集的烤鱼片样品中是否存在河豚鱼成分。

2 结果

2.1 样品中DNA 提取效果 按照试剂盒操作步骤，提取样品DNA，用NANO200仪器测定DNA的纯度和浓度（表3）。

表3 河豚鱼样品DNA 提取结果

2.2 退火温度对PCR 反应结果的影响 从图1可见，随着退火温度的升高，PCR 反应的杂带逐渐减少，在退火温度为68℃时，几乎没有杂带出现，所以选择68℃为最佳退火温度。

2.3 镁离子浓度对PCR 反应结果的影响 从图2可见，当镁离子的浓度低于2.0mmol/L 时，PCR反应不能正常进行，所以选择镁离子的浓度为2.0mmol/L 作为PCR 反应的最佳镁离子浓度。

图2 镁离子浓度对PCR 结果的影响

2.4 DNA 模板浓度对PCR 反应结果的影响 从图3可见，河豚鱼DNA 的模板量达到0.1μg 时，就可以检测到河豚鱼成分。随着河豚鱼DNA 模板量逐渐增加，PCR 扩增出的条带也逐渐变粗和变亮。

图3 DNA 模板对PCR 结果的影响

2.5 河豚鱼成分PCR 鉴定方法与其他鱼种的交叉反应 交叉反应是用本实验所建立的河豚鱼PCR 检测方法，仅能扩增出河豚鱼鱼种的DNA 条带，而不会扩增出其他常见鱼种，例如鲤鱼、鲫鱼等DNA 的条带，即通过PCR 检测，如果在800bp附近出现特异的DNA 条带，则说明一定有河豚鱼的DNA。在本实验中，提取市场上常见水产品鲤鱼、鲫鱼、青鱼和草鱼基因组DNA，进行PCR 反应，实验结果见图4。从图4可以看出，仅河豚鱼的DNA 在800bp 附近出现DNA 条带，鲤鱼、鲫鱼、青鱼和草鱼则无DNA 条带出现，说明本方法具有较好的特异性，与鲤鱼、鲫鱼、青鱼和草鱼没有交叉反应。

图4 河豚鱼鉴定PCR 方法特异性研究

2.6 烤鱼片样品的检测 从市场上随机购买烤鱼片样品3份，用PCR 方法进行检测，以河豚鱼样品DNA 作为阳性对照，以水作为阴性对照。电泳结果见图5。

图5 烤鱼片样品中河豚鱼成分检测

3 讨论

3.1 PCR 最佳反应条件的选择 退火温度对PCR 结果有影响。退火温度越低，PCR 的非特异性扩增就越多，反之，提高退火温度，可以有效降低非特异性扩增条带的出现，结果的特异性就越好。在本实验中，为了保证较好的检测结果，选择PCR 的退火温度为68℃。

镁离子是PCR 反应必须的，低浓度的镁离子不能激活Taq 酶（DNA 聚合酶），PCR 反应不能正常进行，当镁离子达到一定浓度时，才能有效地催化Taq 酶，使PCR 反应顺利进行。本研究中，当镁离子浓度大于2.0mmol/L，才能使PCR 反应顺利进行。

模板DNA 的量对PCR 结果也有影响。适当增加模板DNA 的量，可以使电泳结果更加清晰。

本实验经过3批次重复，河豚鱼样品的DNA 均在800bp 左右出现相应电泳条带，实验结果稳定。

3.2 河豚鱼特异性靶基因的选择 应用分子标记和分子分类系统对物种进行研究的想法要追溯到1993年［3］。2002年Tautz 等首先提出DNA 分类的概念，即以DNA 为基础建立物种识别体系。2004年，Hebert 等提出利用线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）的基因序列作为物种鉴定的靶基因［4-5］。随后Ward 等应用COⅠ基因序列对澳大利亚270种海洋鱼类进行研究，结果显示种内平均差异为0.39%，属内的种间平均差异9.93%，科内的种间平均差异15.5%，而目内的种间平均差异增加到22.2%～23.3%，实验证明COⅠ可以成功地对鱼类进行鉴定［6］。因此，本研究选择了河豚鱼线粒体细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ（COⅠ）的一段长约810bp 的序列作为河豚鱼鉴定的靶基因。

3.3 关于样品检测 本研究检测的3份烤鱼片样品，没有检出河豚鱼成分。这次检测的样品数量较少，后续应检测更多的样品验证这种方法。由烤鱼片引起的河豚毒素中毒，在我国时有发生，主要是在制作烤鱼片的过程中混入了有毒的河豚鱼，致使消费者误食河豚鱼，引起中毒反应［7］。传统的形态学鉴定方法无法满足烤鱼片中河豚鱼成分的鉴定，因此，本研究尝试利用PCR 方法，针对河豚鱼特异性靶基因进行检测，鉴定烤鱼片中是否含有河豚鱼成分，防止消费者误食河豚鱼引起中毒反应，这种方法是可行的。