复方菝葜颗粒的超高效液相色谱指纹图谱及化学模式识别研究

何 丹， 陈 林， 周融融， 朱立华， 张水寒*,

(1.湖南省中医药大学，湖南长沙 410208；2.湖南省中医药研究院中药研究所，湖南长沙 410013；3.长春中医药大学，吉林长春 130117；4.湖南国华制药有限公司，湖南长沙410013)

复方菝葜颗粒(Compound Rhizome Smilacinus Granule，CRSG)是“湖南国华制药有限公司”具有独家知识产权的抗肿瘤制剂，该制剂由菝葜、鱼腥草、猫爪草、款冬花、土鳖虫、枸杞子、大枣七味中药材和鲜鳢鱼组成，为临床癌症辅助治疗的常用药物。现有研究表明，CRSG具有抗炎、镇痛、抗氧化、抗肿瘤和增强机体免疫等活性，适宜用于改善非小细胞肺癌、子宫颈癌伴有咳嗽、胸痛、带下异常等症状，该药可供多种癌症的辅助治疗运用[1 - 2]。

指纹图谱以系统的化学成分研究为导向，体现系统性、特征性、稳定性三原则，实现质量控制的标准化、规范化、客观化，对于复杂体系的药物质量控制更全面。与高效液相色谱法(HPLC)相比，超高效液相色谱法(UPLC)在中药材有效成分检测和质量控制方面，具有可以提供分离度更高，检测更灵敏，大大缩减分离时间的优势[3 - 4]。无监督模式识别，如：系统聚类分析(HCA)及主成分分析(PCA)可综合多指标、多变量信息生成具有代表性的新指标反应样本间的关系；而有监督模式识别如：偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)、神经网络(NN)、正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)等是更为高级的样本分类方法，它们以主成分作为新变量进一步确证样本间差异的稳定性及可靠性，同时寻找差异性代表。这种识别模式也广泛应用于中药材及制剂的质量控制中。

本研究采用超高效液相色谱(UPLC)技术和化学模式识别方法，发现新绿原酸、绿原酸和金丝桃苷可使不同批次间的复方菝葜颗粒样本分为两组，且这3个成分对复方菝葜颗粒发挥改善非小细胞肺癌和子宫颈癌等作用有贡献[8 - 11]；有望进一步研究作为复方菝葜颗粒质量控制的活性成分群。本研究是对现有方法的有效补充，化学模式识别更加适合多类数据的分类分析，能为复方菝葜的质量评估提供新的方法和依据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂及材料

1290 Infinity型高效液相色谱系统(安捷伦科技公司)；AL204电子分析天平(梅特勒-托利多公司)；KM-500DB型超声波清洗器(昆山美美超声仪器有限公司)；冷冻干燥机(宁波双嘉仪器有限公司)。

绿原酸对照品(纯度≥99.39%，批号：MUST-17030620)购自成都曼斯特生物科技有限公司；落新妇苷对照品(纯度≥98%，批号：1DBG-QHTR)购自中国食品药品检定研究院;新绿原酸对照品(纯度≥98%，批号：CHB170914)、隐绿原酸对照品(纯度≥98%，批号：CHB170828)、金丝桃苷(纯度≥98%，批号：CHB160904)、异槲皮苷(纯度≥98%，批号：CHB160912)、3，5-二咖啡酰奎宁酸对照品(纯度≥98%，批号：CHB171013)、3，4-二咖啡酰奎宁酸对照品(纯度≥98%，批号：CHB160725)、4，5-二咖啡酰奎宁酸对照品(纯度≥98%，批号：CHB160726)均购自成都克洛玛生物科技有限公司。甲酸和甲醇均为色谱纯(美国TEDIA公司)，其余试剂均为分析纯，水(华润怡宝饮料(长沙)有限公司)。

经湖南省中医药研究院中药研究所刘浩助理研究员鉴定，菝葜为百合科植物菝葜SmilaxchinaL.的干燥根茎；鱼腥草为二白草科植物蕺菜Houttuyniacordata Thunb.的新鲜全草或干燥地上部分；猫爪草为毛莨科植物小毛莨RanunculusternatusThunb.的干燥块根；枸杞子为茄科植物宁夏枸杞LyciumbarbarmL.的干燥成熟果实；大枣为鼠李科植物枣ZiziphusjujubaMill.的干燥成熟果实；款冬花为菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾；土鳖虫为鳖蠊科昆虫地鳖EupolyphagasinensisWalker或冀地鳖SteleophagaPlancyi(Boleny)的雌虫干燥体。复方菝葜颗粒(湖南国华制药有限公司，批号依次为S1：20170901、S2：20170902、S3：20171201、S4：20171202、S5：20180301、S6：20180302、S7：20180303、S8：20180401、S9：20180402、S10：20180403)。

1.2 色谱条件

色谱柱：EC-C18柱(50×3.0 mm，2.7 μm)；流动相：A为甲醇，B为0.3%甲酸水溶液。梯度洗脱程序：0～2 min，2%A；2～5 min，2%～7%A；5～12min，7%～11%A；12～15min，11%～14%A；15～17 min，14%～16%A；17～18 min，16%～18%A；18～20 min，18%～20%A；20～21 min，20%～24%A；21～24 min，24%～26%A；24～28 min，26%～28%A；28～29min，28%A；29～30 min，28%～31%A；30～35 min，31%～48%A；35～38 min，48%A。体积流量：0.6 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：2 μL；检测波长：280 nm。

1.3 溶液的制备

1.3.1 对照品溶液取绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异槲皮苷、金丝桃苷、落新妇苷、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸，4，5-二咖啡酰奎宁酸各对照品适量，加适量甲醇制成含绿原酸90 μg/mL、新绿原酸102.7 μg/mL、隐绿原酸72.8 μg/mL、金丝桃苷101.8 μg/mL、落新妇苷133 μg/mL、异槲皮苷104.8 μg/mL、3，4-二咖啡酰奎宁酸217.8 μg/mL、3，5-二咖啡酰奎宁酸93.2 μg/mL，4，5-二咖啡酰奎宁酸95.5 μg/mL的对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液精密称取复方菝葜颗粒1.0 g，加甲醇定容至10 mL，称重后密闭，于250 W、40 kHz超声溶解，放冷后，加甲醇补足失重，摇匀，过滤，取滤液用0.22 μm滤膜过滤，得到复方菝葜颗粒提取物，备用。

1.3.3 单味药材供试品溶液精密称取菝葜、鱼腥草、猫爪草、枸杞子、大枣(去核)各15 g，款冬花、土鳖虫各5 g，第一次加940 mL水(煎煮1.5 h)，第二次加752 mL水(煎煮1 h)，合并煎煮液，浓缩，利用冷冻干燥仪干燥，得浸膏,备用。

1.4 方法学考察

1.4.1 精密度试验取同一供试品溶液(S1)，连续进样6次，记录色谱指纹图谱，选择出峰稳定、峰面积较大、响应值最高、分离度良好的8号峰(绿原酸)为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差(RSD)均低于2%，表明仪器精密度良好。

1.4.2 重复性试验分别取CRSG(S1)6份，按照1.3.2方法制备供试品溶液，按照1.2色谱条件进行检测，记录指纹图谱，以8号峰(绿原酸)为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均低于2%，表明该方法重复性良好。

1.4.3 稳定性试验取同一供试品溶液(S1)，分别于0、4、8、12、16、24 h进样检测，记录指纹图谱，以8号峰(绿原酸)为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均低于2%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

图1 10批次复方菝葜颗粒UPLC指纹图谱及其对照色谱图Fig.1 UPLC fingerprints of ten batches of compound Rhizoma Smilacinus granul

2 结果与讨论

2.1 指纹图谱的建立及共有峰指认

2.1.1 指纹图谱的建立按照1.3.2方法制备10批次样品的供试品溶液，各取2 μL在1.2色谱条件下进行色谱峰采集，得到10批CRSG的指纹图谱，见图1。确定18个色谱峰为10批CRSG所共有。使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A版)”软件计算模拟得到对照色谱图(R，见图1)。以8号峰(绿原酸)为参照色谱峰(S)，计算10批CRSG各个色谱峰的相对保留时间，结果见表1。结果显示，不同批次间各共有峰的保留时间tR和相对峰面积的RSD大部分均在1%左右，初步判断10批复方菝葜颗粒样品成分较稳定，但仍存在一定差异。

表1 10批复方菝葜颗粒指纹图谱共有峰相对保留时间

2.1.2 共有峰归属取1.3.1项下制备的除鲜鳢鱼外的其余7味药材样品，分别精密吸取2 μL进样并记录UPLC色谱图，确认复方菝葜颗粒UPLC指纹图谱的18个特征峰的来源(图2)。7种单味药材对复方菝葜颗粒UPLC指纹图谱均有贡献，其中2、4、5、7、8、10、12～16号峰来自菝葜，2号峰来自鱼腥草，1、3、9号峰来自猫爪草，5、7、9、13、14、17、18号峰来自款冬花，1和6号峰来自枸杞子，11号峰来自大枣。其中不同的单味药材有多个共有峰，表明中药材中其成分的复杂性。菝葜和款冬花拥有多个不同的共有峰，表明了这2味药材对于整个复方的化学成分的重要性。

图2 复方菝葜颗粒和各单味药UPLC指纹图谱Fig.2 UPLC fingerpint of compound Rhizoma Smilacinus granul and single herb medicine

2.1.3 共有峰指认精密吸取对照品溶液、供试品溶液各2 μL，进样并记录色谱图，对各色谱峰进行成分指认，见图3。经过相对保留时间和色谱峰行为比对，共确认9个已知成分。分别为：5号峰(新绿原酸)、8号峰(绿原酸)、10号峰(隐绿原酸)、12号峰(落新妇苷)、13号峰(金丝桃苷)、14号峰(异槲皮苷)、15号峰(3,4-二咖啡酰奎宁酸)、16号峰(3,5-二咖啡酰奎宁酸)、18号峰(4,5-二咖啡酰奎宁酸)。

图3 复方菝葜颗粒指纹图谱特征峰指认Fig.3 Characteristic peak attribution in fingerprint of compound Rhizoma Smilacinus granul

2.2 相似度评价

采用相似度软件计算样品S1～S10的相似度，结果依次为：0.974、0.973、0.979、0.982、0.991、0.991、0.994、0.992、0.988、0.991。由此可知，10批次样品中S5、S6、S7、S8、S9、S10相似度良好，均大于0.985；S1、S2、S3、S4相似度稍低，均大于0.970。来自不同批次CRSG样品的UPLC色谱图是相似的，各批次制剂共有成分出峰时间大致相同，成分较稳定。

2.3 系统聚类分析(HCA)

采用SPSS 21.0统计分析软件进行系统聚类，对10批次复方菝葜颗粒进行聚类分析，结果见图4。聚类结果显示，10批次制剂大致可分为两类：即2017年的各批次S1、S2、S3、S4聚为一类，2018年S5、S6、S7、S8、S9、S10聚为一类，其结果与相似度评价结果相互印证。可见不同批次的复方菝葜颗粒各成分稳定存在，在批次间各成分的含量还存在一定差异。

2.4 主成分分析(PCA)

将10批次复菝葜颗粒样品的18个共有峰及其峰面积，创建10×18数据矩阵，导入SIMCA 13.0软件，对样品进行无监督模式的PCA。获得样本PCA得分图(图5)，变量载荷图(图6)。可见不同年份批次间有一定分开的趋势，其中：S1～S4为一组，S5～S10为一组，与系统聚类分析结果相仿，但中间仍有重叠部分。需要更高级的模式识别方法进一步对样品分类。

图4 聚类分析树状图Fig.4 Dendrogram of cluster analysis

图5 10批样品(S1～S10)的PCA得分图Fig.5 PCA of score plot for10 samples(S1-S10)

2.5 正交偏最小二乘判别法分析(OPLS-DA)

图6 18个变量的载荷图Fig.6 Loading plot for 18 variables(S1-S12)

图7 10批样品(S1～S12)OPLS-DA得分图Fig.7 OPLS-DA score plot of 10 samples

图8 变量重要性投影图Fig.8 VIP plot of OPLS-DA

3 结论

本研究采用UPLC法建立复方菝葜颗粒指纹图谱，对各成分进行药材归属，并对主要特征峰进行指认，通过相似度评价和HCA、PCA、OPLS-AD等化学计量学方法考察批次间稳定性，寻找造成批次间差异的特征性成分，希望为建立全面可靠的复方菝葜颗粒质量控制标准提供理论依据。