酶水解-液相色谱法测定婴幼儿食品中的色氨酸

孙立臻，别梅，冯峰，王骏，祝建华，刘艳明，张峰

（1.山东省食品药品检验研究院，济南250100；2.山东省特殊医学用途配方食品质量控制工程技术研究中心，济南250100；3.中国检验检疫科学研究院，北京100176）

0 引言

L-色氨酸（L-Tryptophan）是人体必需的一种氨基酸[1]，婴幼儿如果缺乏色氨酸，会导致其蛋白质和脂肪代谢障碍，影响其正常的生长发育[2-3]。我国的标准[4-5]中，均规定婴幼儿食品中允许添加L-色氨酸，并对含量有明确要求。但我国缺乏相关产品中色氨酸的检测标准，使政府监管和企业质量控制难以有效开展。

目前国内外对于乳粉中色氨酸的检测的报道较少，对特殊医学食品中色氨酸的检测的报道几乎没有。已有的色氨酸的检测方法主要有分光光度计法[6-7]、离子交换色谱法[8]、液相色谱[9-10]和液-质联用法[11]等方法，前处理过程一般为碱水解法[12-14]，碱水解法水解产物复杂、重现性差、灵敏度较低[15]。本研究建立了一种准确测定婴幼儿食品中色氨酸含量的酶解-高效液相色谱法。该法准确度高、重现性好，对N IST标准乳粉（1849a）的测定结果满意，可用于市售婴幼儿配方乳粉及医学食品中色氨酸含量的检测，为乳粉和医学食品中色氨酸的监管提供了技术支持。

1 实验

1.1 材料与试剂

L-色氨酸标准品Bepure；XBridge C 18色谱柱(150 mm×4.6 mm，3.5μm)；甲醇(色谱纯)；T ris碱；盐酸；乙酸；氢氧化锂；蛋白酶；N IST乳粉标准品（1849a）；乳粉和医学食品。

1.2 仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱仪(配备荧光检测器2475和二极管阵列检测器2998)；AB204-S型电子天平；SB-800DTD型超声波清洗器；3-18K型冷冻离心机；Milli-Q超纯水制备器；涡旋混合器；DNP-9162BS-III电热恒温培养箱。

1.3 试剂的配制

1.3.1 L-色氨酸标准溶液的配制

准确称取10 m g（精确到0.1 m g）L-色氨酸标准品于10 m L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀。然后用水逐级稀释到质量浓度为0.2～100μg/m L，临用前配制。

1.4 色谱条件

W aters Xbridge C 18色谱柱(3.5μm，150 mm×4.6 mm)；流动相：A为甲醇，B为0.1%乙酸；流速0.8 m L/m in；进样体积10μL；激发波长295 nm，发射波长345 nm；柱温35℃；等度洗脱条件为：甲醇0.1%，乙酸水=10∶90。

1.5 样品处理

1.5.1 游离色氨酸的测定

称取混合均匀的固体试样500 m g（精确到0.1 m g）于50 m L刻度管中，加入2 m L水，超声溶解，加入12 m L甲醇，充分混匀沉淀蛋白，用水定容至50 m L刻度，冷冻离心，滤液经0.22μm微孔滤膜过滤，液相色谱测定。

1.5.2 色氨酸总量的测定（酶水解法）

称取混合均匀的固体试样200 m g（精确到0.1 mg）于50 m L带螺纹的离心管中，加入0.5 m L蛋白酶溶液（质量浓度5 mg/m L），3.0 m L Tris碱缓冲液（浓度为0.1 m o l/L，p H=8.5），200μL甲醇，超声溶解，混合均匀，于50℃恒温培养箱中18 h至酶解完全待样品冷却至室温，加入12 m L甲醇。用水定容至50 m L，混匀后冷冻离心，滤液经0.22μm微孔滤膜过滤，液相色谱测定。

1.5.3 色氨酸总量的测定（碱水解法）

称取混合均匀的固体试样200 m g（精确到0.1 m g），置于带螺纹的聚四氟乙烯水解管中，加5 m L浓度为4 mol/L的氢氧化锂溶液，充氮气后，旋紧盖子，放入(110±1)℃恒温干燥箱，水解20 h。冷却至室温，混匀开管，用水将水解液定量地转移到50 m L刻度管中，浓度为6 m ol/L的盐酸溶液调节pH值到中性，并用水定容至刻度，混匀后冷冻离心，滤液经0.22μm微孔滤膜过滤，液相色谱测定。

1.5.4 空白实验

除不加试样外，其他操作步骤同试样的操作步骤。

2 结果与讨论

2.1 水解方式的考察

本研究选取婴幼儿配方乳粉和医学食品进行了碱水解法和酶水解法的对比，表1结果表明，酶水解法的测定结果（扣除空白值）均不同程度的高于碱水解法的结果。乳粉的测定结果差异较小，在6.3%～9.0%之间；医学食品的测定结果差异较大，在6.0%～21.2%之间，差异最大的是含有大量游离色氨酸的氨基酸配方医学食品，其次是添加了不同程度水解乳清蛋白粉的深度水解配方医学食品和部分水解配方医学食品，而无乳糖配方、早产儿配方和全营养配方的医学食品测定结果差异稍小。

根据产品标签分析，氨基酸配方和部分/深度水解配方的医学食品中添加的是游离色氨酸和经过不同程度水解得到的小分子肽段，高浓度的碱液对其具有不同程度的破坏作用，导致其结果比酶水解法偏低很多；其余几种配方的医学食品与乳粉的基质类似，调整的仅是维生素、矿物质等营养指标，故其测定结果的差异程度与乳粉类似。无论是从操作的简便程度，还是结果的准确度上考虑，酶水解法都更适用于乳粉和医学食品中色氨酸的测定。

表1 碱水解法与酶水解法的结果对比

2.2 酶解条件的优化

2.2.1 酶解温度

以标准乳粉1849a（（184±10）m g/100g）作为实验样品，固定酶的加入量（0.5 m L）和酶解时间（18 h），分别考察反应体系在40，45，50，55，60℃等不同温度下的结果；结果表明，当酶解温度为50℃，达到酶解峰值，如图1所示。

2.2.2 酶解时间

以标准乳粉1849a作为试验样品，固定酶的加入量（0.5 m L）和酶解温度（50℃），分别考察反应体系在不同酶解时间（14，16，18，20，22，24 h）的结果。实验结果表明，当酶解的时间超过16 h以后，结果趋于稳定，证明酶解充分。综合时间、效率、准确度等因素，18 h为最佳的酶解时间，结果如图2所示。

2.2.3 酶的用量

以标准乳粉1849a作为实验样品，固定酶解温度（50℃）和酶解时间（18 h），分别考察酶的用量对结果的影响。结果均为扣除试剂空白以后的结果。实验结果表明，当酶的用量超过0.5 m L以后，结果趋于稳定，综合考虑到成本等问题，酶的最佳用量为0.5 m L，结果如图3所示。

图1 1849a在不同酶解温度下的结果

图2 1849a在不同酶解时间下的结果

图3 1849a在不同酶用量下的结果

2.3 色谱条件的优化

2.3.1 色谱柱

本研究比较了Therm o Acclaim C 8（3.0 mm×150 mm，3μm），Waters Xbridge C 18（4.6 mm×150 mm，3.5μm），W aters Atlantis T 3（4.6 mm×250 mm，5μm）3种类型的色谱柱，验证色氨酸的色谱保留行为。实验结果表明，色氨酸在3种色谱柱条件下均能有很好的保留，从方法的适用性及普及性上考虑，C 18色谱柱更为常规和普及，故最终选择Waters Xbridge C 18（4.6 mm×150 mm，3.5μm）柱作为分析柱。

2.3.2 流动相

本研究分别考察了甲醇-0.5 m o l/L磷酸二氢钠缓冲盐溶液（pH=2.3），甲醇-0.1%磷酸水溶液，甲醇-0.1%乙酸水溶液3种流动相体系，在合适的有机相洗脱条件下，均能够很好的分离目标物，且无干扰，综合考虑磷酸盐容易堵塞色谱柱、不易冲洗等原因，最终选择甲醇-0.1%乙酸水溶液作为流动相条件。

2.3.3 检测器

L-色氨酸具有吲哚环的结构，因此在紫外检测器和荧光检测器上均有较强的吸收。L-色氨酸在219 nm和278 nm处均有较强的紫外吸收，光谱图（见图4）。考虑到219 nm附近的干扰较多，故选择278 nm作为紫外检测器测定波长。本研究分别考察了乳粉1849a在278 nm处的紫外色谱图和激发波长295 nm，发射波长345 nm处的荧光色谱图（见图5）。结果表明，L-色氨酸在紫外检测器和荧光检测器上均具有良好的响应，目标峰处均无干扰。通过对样品的测试表明，两种检测器的定量结果无差异，结果如图6所示。考虑到荧光检测器具有更强的特异性，故选择荧光检测器作为主要的定量手段，紫外检测器作为辅助定性定量的手段，本研究的方法学数据均为荧光检测器的结果。

图4 L-色氨酸的光谱图

图5 L-色氨酸的色谱图

图6 紫外检测器和荧光检测器定量结果

2.4 方法线性及检出限

在上述优化的实验条件下，本研究考察了色氨酸在0.2～100μg/m L质量浓度范围内的线性关系和相关系数，结果表明色氨酸在该浓度范围内线性关系良好，线性回归方程为

Y=388456X+36512，相关系数(r)大于0.9999。综合考虑信噪比和仪器分析的线性范围，确定方法的检出限和定量限分别为1.5 m g/100g和5 mg/100g。本方法的灵敏度完全能够满足对乳粉和医学食品中色氨酸的检测需求。

2.5 精密度与回收率

本研究对乳粉1849a进行了6平行的测定实验，并通过向样品中添加低、中、高3个浓度水平的色氨酸标准溶液，使样品中色氨酸质量分数分别为（284，684，1184）m g/100g，每个水平平行测定6次，按上述样品制备方法操作，分别得到精密度和回收率。结果表明，本方法色氨酸的回收率在99.0%～105.3%之间，相对标准偏差(RSD)为1.52%～2.01%，结果如表2所示。这说明本方法完全能够满足实际样品检测的需求。

3 方法应用

本研究依照上述所建立的方法对购自市场和企业不同品牌、不同配方的国内外乳粉和医学食品进行了测定。并分别比较了各种配方的样品中游离色氨酸与总色氨酸的关系。

婴幼儿配方乳粉中最常见的是牛奶粉和羊奶粉，奶粉中乳蛋白的水解是色氨酸的主要来源。本研究测定了来自不同品牌的5种牛奶粉和5种羊奶粉的色氨酸，结果如表3所示。多数奶粉中游离色氨酸的量低于定量限，说明样品中的色氨酸来源于乳蛋白的水解。而牛奶粉5的游离色氨酸的量为25 m g/100g，样品标签显示其添加了单体色氨酸，这与本研究的结果一致。

表2 L-色氨酸的加标回收率及精密度

特殊医学用途婴儿配方食品的常见配方有6种，包括氨基酸代谢障碍配方、乳蛋白深度水解配方、乳蛋白部分水解配方、全营养配方（母乳营养补充剂）、早产/低出生体重儿配方和低乳糖配方。本研究对6种配方的样品进行了测定，并比较了游离色氨酸的比重，结果如表4所示。根据GB 25596规定，氨基酸代谢障碍配方中添加的是游离态氨基酸，包括L-色氨酸，研究结果显示氨基酸代谢障碍配方中游离色氨酸占总色氨酸的99%以上；乳蛋白深度水解配方适用于食物蛋白过敏的婴儿，不含有食物蛋白，添加成分为深度水解为氨基酸和肽段的乳清蛋白粉，研究结果显示乳蛋白深度水解配方中既有游离态的色氨酸，也有水解色氨酸，游离色氨酸占总色氨酸的37.6%～61.4%；部分水解乳清蛋白粉配方添加的是经加工分解成小分子乳蛋白、肽段和氨基酸的乳清蛋白粉，会有少量游离色氨酸的检出，这与本研究结果相吻合，游离色氨酸占总色氨酸的6.4%～10.8%；其他配方（无/低乳糖配方、早产/低出生体重儿配方和全营养配方）的医学食品仅在普通乳粉的基础上，对能量、乳糖、某些矿物质和维生素等的含量进行了调整，因此总色氨酸的量均来自于蛋白水解色氨酸，这与本研究的结果一致，这几种配方的医学食品中游离色氨酸的量均低于定量限。

表3 乳粉中游离色氨酸及总色氨酸的质量分数比对结果

表4 特殊医学用途婴儿配方食品中游离色氨酸及总色氨酸质量分数比对

4 结论

本研究通过酶水解法，建立了婴幼儿配方乳粉和特殊医学用途婴儿配方食品中色氨酸的高效液相色谱法。该方法准确度好，灵敏度高。将该方法应用于实际乳粉和医学食品的检测结果表明，不同基质和配方的样品之间，色氨酸的总量差异较大，游离色氨酸占色氨酸总量的比重也各不相同。本方法为制定婴幼儿配方食品特殊医学用途婴儿配方食品中色氨酸的检测标准提供了技术支持。