山东省小麦茎基腐病的病原鉴定

孟程程,孙晓凤,张 莉,闫佩瑶,于金凤

山东省小麦茎基腐病的病原鉴定

孟程程,孙晓凤*,张 莉,闫佩瑶,于金凤**

山东农业大学 植物保护学院, 山东 泰安 271018

为明确山东小麦茎基腐病的病原组成及优势菌群，本研究自山东省济南、泰安、德州、潍坊、烟台、聊城、菏泽、临沂等8个地区，共采集200余份小麦茎基腐病发病样本，分离获得224个菌株，从中选取190个代表性菌株，对其EF-1α序列进行分析，鉴定其所属类群并测定不同病原菌的致病性。结果表明：190个菌株中包含142株假禾谷镰孢菌（）、35株禾谷镰孢菌()、6株轮枝镰孢菌()和7株层出镰孢菌()，假禾谷镰孢菌占鉴定菌株的74.7%，是山东省小麦茎基腐病的优势病原菌。致病性测定结果表明，分离得到的不同种镰孢菌均对小麦植株具有致病力，但假禾谷镰孢菌致病力最强。

小麦茎基腐病; 病原菌; 假禾谷镰孢菌; 致病性

小麦茎基腐病（Wheat Crown Rot）是一种典型的土传性真菌病害，该病害最早报道于澳大利亚[1]，之后在亚洲[2-6]、非洲[7]、北美洲[8,9]、南美洲[10]以及大洋洲[11]等世界各小麦产区均有发生报道。该病害在小麦生长全期均可发生，播种期侵染造成小麦烂种；苗期侵染使小麦茎基部腐烂，发病后期严重时导致小麦枯白穗，造成减产甚至绝产[12]。

近年来，我国各地小麦茎基腐病发生频繁，山东省小麦茎基腐病的发生也呈加重趋势。病原菌鉴定对病害的防控十分重要，目前尚无对山东省小麦茎基腐病病原菌的系统报道。本试验对山东省8个地区的小麦茎基腐病病菌进行了分离鉴定，采集地基本涵盖了不同小麦种植区，分离鉴定结果比较客观地反映了小麦茎基腐病病原菌的组成，对山东省小麦茎基腐病的防治有一定的借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集小麦茎基腐病样本采集自山东省济南、德州、聊城、菏泽、泰安、潍坊、烟台、临沂等8个地区。

1.1.2 培养基 PDA培养基，用于病原菌的分离纯化；CMC培养基，用于病原菌分生孢子的培养。

1.2 病原菌的分离

取病株茎基部发病部位剪成约0.5 cm的片段，0.1%升汞浸泡30 s，75%酒精浸泡30 s，无菌水漂洗3次，灭菌滤纸吸干表面水分后置于PDA培养基中，光照培养箱中25 ℃培养，挑取新生菌落边缘菌丝继续纯化培养，结合《常见镰刀菌鉴定指南》[13]将具有镰孢菌形态特征的菌株进行保存。

1.3 病原菌的鉴定

1.3.1 病原菌的形态学鉴定将纯化的病原菌接种到PDA培养基上，在智能光照培养箱中25 ℃培养5~7 d，观察菌落形态和色素产生情况；接种病原菌到100 mL CMC培养基中，25 ℃、160 rpm培养3 d，采用显微镜(尼康90i)观察分生孢子及分生孢子梗形态。结合《常见镰刀菌鉴定指南》对不同病原菌进行形态学鉴定。

1.3.2 病原菌的分子生物学鉴定EF-1α基因对于镰孢菌种级水平的区分鉴定具有有效性[14]，本研究采用CTAB法[15]提取供测菌株的基因组DNA。使用EF-1α基因序列特异性引物EF-1T(5′-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3′)，EF-2T(5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′)进行PCR扩增[16]。PCR反应体系为：DNA模板2 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、10×EsayTaq 5 μL、dNTPs 4 μL、EasyTaq DNA Polymerase 1 μL，加ddH2O至50 μL。扩增条件：94 ℃ 90 s，92 ℃ 30 s，55 ℃ 90 s，72 ℃ 90 s，72 ℃ 3 min。扩增产物采用1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测并送上海博尚生物科技有限公司进行测序。测序结果在NCBI中进行BLAST比对。

1.4 病原菌的系统进化分析

依据测序结果，选取不同种镰孢菌的代表菌株，使用MEGA5.1以邻接法构建系统进化树。

1.5 病原菌的致病性测定

1.5.1 带菌麦粒培养基的制备选取饱满麦粒沸水煮至微微开裂，转移至锥形瓶中高温蒸汽灭菌，随机选取不同种镰孢菌菌株接种灭菌麦粒，菌株编号分别为假禾谷镰孢菌WHF104、禾谷镰孢菌WHF57、轮枝镰孢菌WHF203和层出镰孢菌WHF149，25 ℃培养至菌丝布满锥形瓶，取出带菌麦粒晾干备用。

1.5.2 病原菌的接种温室盆栽条件下，以济麦22为试验材料，无菌水浸泡24 h催芽，将萌发麦粒与带菌麦粒培养基一齐播种至育苗盆中，带菌麦粒位于萌发种子下方1 cm处。共设置4个重复，每个重复播种5个麦粒，以不接种带菌麦粒的小麦植株作为对照。

1.5.3 病情指数的计算接种30 d后对小麦植株发病情况调查，室内盆栽小麦茎基腐病的分级标准为：0级：整株无变褐症状；1级：植株仅第一叶鞘变褐，且变褐面积不超过1/2；3级：植株仅第一叶鞘变褐，且变褐面积超过1/2；5级：植株第二叶鞘变褐；7级：植株第三叶鞘变褐或植株死亡。

统计不同处理小麦茎基腐病发病级数并计算病情指数。利用DPS2000软件进行差异显著性分析。

病情指数=100×Σ（各级发病个数×各级代表值）/（调查总个数×最高级代表值）

2 结果与分析

2.1 小麦茎基腐病病原的分子鉴定

从采集的小麦茎基腐病样本中，共分离得到224个小麦茎基腐病菌株，并编号（见表1）。

表1 小麦茎基腐病病原菌的分离

根据菌落特征，选取190个代表菌株对其EF-1α基因进行特异性扩增，获得约710 bp大小的片段（见图1）。扩增产物送上海博尚生物技术服务有限公司进行测序。将测序结果在Gen Bank中进行序列比对，鉴定其所属种群（见表2）。

结果表明，190个菌株中有142株假禾谷镰孢菌、35株禾谷镰孢菌、6株轮枝镰孢菌及7株层出镰孢菌。假禾谷镰孢菌占总体74.74%，为优势病原菌。不同地区均以假禾谷镰孢菌为主要病原菌。从不同种镰孢菌中随机选取27个代表菌株，使用MEGA5.1构建系统进化树(图2)。

图2 基于EF-1α基因构建的系统发育树

由图2可以看出，假禾谷镰孢菌与禾谷镰孢菌之间亲缘关系较近，层出镰孢菌和轮枝镰孢菌之间种间亲缘关系较近；同种镰孢菌的不同菌株也存在分支，这些分支与地理来源无明显联系，4种镰孢菌均存在较明显的遗传分化现象，遗传多样性丰富。

2.2 小麦茎基腐病病原菌的形态特征

为进一步获得不同镰孢菌的形态学特征，将4种镰孢菌分别接种到PDA培养基和CMC培养基中，观察不同种镰孢菌的菌落形态、分生孢子和分生孢子梗形态（见图3）。

图3 四种镰孢菌的菌落形态、分生孢子及分生孢子梗形态

注：A，E为假禾谷镰孢菌菌落形态及分生孢子、分生孢子梗；B，F为禾谷镰孢菌菌落形态及分生孢子、分生孢子梗；C，G为轮枝镰孢菌菌落形态及分生孢子、分生孢子梗；D，H为层出镰孢菌菌落形态及分生孢子、分生孢子梗。Bar=10 μm。

Note: These pictures showed that colony morphology, conidium and conidiophore in fourspp., A, E belong to; B, F belong to; C, G areand D, H are. Bar=10 μm.

如图3所示，不同镰孢菌菌落形态区别较为明显，假禾谷镰孢菌菌丝直立致密呈白色，中心菌丝为黄色，产红色，黄色色素或不产色素，分生孢子多为大型分生孢子，镰刀型，隔膜3~5个；禾谷镰孢菌菌丝白色或黄色，产玫红色或黄色色素，分生孢子多为大型分生孢子，镰刀型，与假禾谷镰孢菌不易区分，隔膜3~5个；轮枝镰孢菌菌丝呈卷曲状，中心菌丝为紫色，边缘菌丝呈白色，产紫色色素，多为大型分生孢子，隔膜2~4个；层出镰孢菌菌丝致密卷曲，产紫色、粉色色素或不产色素，分生孢子多为小型分生孢子，单隔或无隔。除假禾谷镰孢菌外，其他3种镰孢菌形态学特征符合《常见镰刀菌鉴定指南》描述，假禾谷镰孢菌与禾谷镰孢菌在形态特征上比较相似，需辅助于分子生物学方法进行鉴定。

2.3 病原菌致病性的测定

以济麦22为试验材料，测定不同种镰孢菌对小麦植株的致病性（见表3）。

表3 不同镰孢菌对小麦苗期植株的致病性测定

注：病情指数中字母相同表示差异未达显著水平(>0.05)，字母不同表示差异达显著水平(<0.05)。

Note: The same alphabets of disease index list shows no significance (>0.05), on the contrary, having significance (<0.05).

结果表明，不同种镰孢菌对小麦植株均具有致病力，可引起小麦茎基腐病的典型症状，且致病力差异显著。假禾谷镰孢菌致病力最强，接种小麦植株发生死苗，病情指数为100。禾谷镰孢菌、轮枝镰孢菌和层出镰孢菌病情指数分别为68.6、44.3和25.7。

将接种发病的小麦植株经表面消毒后，重新在PDA平板上进行病菌的分离，均仅分离到了对应的接种病菌，说明分离到的4种镰孢菌均为小麦茎基腐病的致病菌。

3 讨 论

本试验自山东省济南、德州、聊城、菏泽、泰安、潍坊、烟台、临沂等8个地区采集小麦茎基腐病样本200余份，分离得到224个镰孢菌菌株，经鉴定包括、、和，其中假禾谷镰孢菌占74.74%，为优势病原菌，该鉴定结果与澳大利亚、美国、及中国大部分地区小麦茎基腐病病原的鉴定结果基本一致[5,6,8,10]，但与李伟、张向向等人的鉴定结果存在差异，他们在对安徽、江苏、河南、湖北、四川、河北等地小麦茎基腐病的病原鉴定中，认为小麦茎基腐病的主要病原菌是禾谷镰孢菌[2,3]。这种差异可能与采集地区及田间气候有关，周海峰对黄淮麦区小麦茎基腐病病原的鉴定结果表明，河南北部以假禾谷镰孢菌为主，中东部则是禾谷镰孢菌和假禾谷镰孢菌混合发生区，江苏及安徽北部以禾谷镰孢菌分离频率最高[4]。

不同镰孢菌对小麦植株的致病性测定结果表明，、、和对小麦植株均具有致病力，且致病力差异显著，测定结果与吴斌等人的测定结果基本一致[5]。假禾谷镰孢菌致病力最高，病情指数为100，对小麦植株的高致病力可能是其成为山东地区小麦茎基腐病优势致病菌的一个重要原因。

本试验明确了山东省小麦茎基腐病的主要致病菌是以假禾谷镰孢菌为主的镰孢菌属真菌，为山东省小麦茎基腐病的综合防治奠定了病原学基础，具有一定的实践应用价值。

4 结 论

（1）山东省小麦茎基腐病的病原鉴定。山东省小麦茎基腐病病原菌包括假禾谷镰孢菌、禾谷镰孢菌、轮枝镰孢菌和层出镰孢菌。假禾谷镰孢菌为优势病原菌；

（2）不同病原菌的致病性测定。不同病原菌对小麦植株均具有致病性，且致病力差异显著。假禾谷镰孢菌致病力最高。

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Pathogen Identification for Wheat Crown Rot in Shandong Province

MENG Cheng-cheng, SUN Xiao-feng*, ZHANG Li, YAN Pei-yao, YU Jin-feng**

College of plant protection/Shandong Agricultural University, Tai’an271018, China

In order to clarify the pathogens composition and dominant species of wheat crown rot in Shandong wheat growing regions, A total of more than 200 samples of wheat stem rot from Jinan, Taian, Dezhou, Weifang, Yantai, Liaocheng, Heze and Linyi was colected, isolated 224 strains, and selected 190 representative strains to analyze their EF-1α sequences and identify the group to which it belongs and determine the pathogenicity of different pathogens. The results showed that among the 190 strains, there are 142 of, 35 of, 6 ofand 7 of.accounts for 74.7% of the identified strains, it is the dominant pathogen of wheat crown rot in Shandong Province.The results of pathogenicity showed that different strains ofspp. had pathogenicity to wheat plants, buthad the strongest pathogenicity.

Wheat crown rot; pathogenic bacteria;; pathogenicity

S435.121

A

1000-2324(2019)05-0753-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.05.004

2019-03-01

2019-04-26

国家重点研发计划课题(2017YFD0201705);山东省现代农业产业技术体系创新团队建设专项资金(SDAIT-01-09)

孟程程(1993-),男,在读硕士,专业方向:植物病理学. E-mail:198227006@qq.com

*同等贡献:孙晓凤(1994-),女,在读硕士,专业方向:植物病理学. E-mail:2536606095@qq.com

Author for correspondence. E-mail:jfyu@sdau.edu.cn