不同妊娠方式及女性年龄对流产组织染色体非整倍性的影响

王珺，陈书强，赵男，张亨德，李懋，王晓红

(空军军医大学唐都医院妇产科生殖医学中心，西安 710038)

近年来，随着人类辅助生殖技术(ART)的广泛应用，其子代安全性问题日益引起人们的重视[1-2]。而ART后自然流产胚胎可能在一定程度上反映ART对胚胎遗传物质的影响。因此，研究ART后自然流产胚胎染色体情况，对从遗传学角度探讨ART的安全性有重要指导意义。本研究拟通过比较自然妊娠和ART妊娠发生早期自然流产的孕妇年龄、胚胎染色体异常率及其分布情况，探讨不同妊娠方式及年龄与胚胎染色体异常的关系，从而为ART在遗传学上的安全性问题提供咨询依据。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2014 ～2018年期间，我中心单胎早期自然流产或胚胎停育后行绒毛染色体非整倍性筛查的患者890例，将自然妊娠后流产的494例患者设为自然妊娠流产组，ART助孕妊娠后流产的396例患者设为辅助生殖妊娠流产组。另外将两组患者以35岁为年龄分割界限，又分为<35岁组和≥35岁组。

二、研究方法

早期自然流产患者无菌清宫手术过程中，取绒毛组织15～20 mg，生理盐水清洗绒毛组织至无血液残留，剔除蜕膜，将绒毛组织剪碎，采用QIAGEN QIAamp DNA mini Kit(Cat.No.51304凯杰企业管理(上海)有限公司，德国)进行绒毛全基因组DNA提取，IonProton二代测序技术(Life Technologies)行检测染色体非整倍性检测。

三、统计学分析

结 果

一、流产患者基本信息及流产组织染色体情况

自然妊娠组患者平均年龄及流产孕周显著小于辅助生殖妊娠流产组(P<0.01)。两组之间染色体非整倍性发生率及性染色体组成情况均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 不同妊娠方式早期流产患者基本信息及流产组织染色体情况[(-±s)， %]

注：与自然妊娠流产组相比，*P<0.01

二、流产组织染色体异常分布

流产组织中，染色体异常样本共计501例，1～22号，X，Y单一染色体异常382例，三倍体异常15例，≥2条染色体异常46例，染色体微缺失/重复58例。染色体出现单一异常的发生率最高，达76.25%。单一发生的染色体异常中，16号染色体异常102例，占26.70%，22号染色体异常及X染色体异常均有54例，发生率均为14.14%。所有流产组织中，无论何种妊娠方式，均无1号染色体及5号染色体异常记录(图1)。

图1 流产组织染色体异常分布

三、不同妊娠方式流产组织染色体异常发生率分析

对于同一类染色体异常，不同妊娠方式流产组的发生率不同。辅助生殖妊娠流产组69，XXN占比(0.86%)显著低于自然妊娠流产组(4.83%)(P<0.01)，而21号染色体异常占比(5.60%)显著高于自然妊娠流产组(2.23%)(P<0.05)。除此以外的其它染色体异常在两组占比无显著差异(P>0.05)。自然妊娠流产组织中有6例为21三体，辅助生殖妊娠流产组织中有9例为21三体，两者相比无显著差异(P>0.05)。两组患者平均年龄亦无显著差异(P>0.05)。辅助生殖妊娠流产组织中存在4例21单体，而自然妊娠流产组织中无该异常(图2，表2)。

四、不同妊娠方式及年龄分组对流产组织染色体异常的影响

辅助生殖妊娠流产组≥35岁流产患者占比显著大于自然妊娠流产组(P<0.001)。不同妊娠方式组内，<35岁患者染色体非整倍性发生率显著低于≥35岁患者(P<0.01)。

染色体非整倍性高发类型中：16号染色体异常发生率在<35岁患者中显著高于≥35岁患者(P<0.01)，而不同妊娠方式间无显著差异(P>0.05)；22号染色体异常发生率在≥35岁人群中显著高于<35岁人群(P<0.01)，而不同妊娠方式间无显著差异(P>0.05)；≥35岁患者≥2条染色体异常发生率显著高于<35岁患者(P<0.001)，且辅助生殖妊娠流产组显著高于自然妊娠流产组(P<0.01)(表3)。

与自然妊娠流产组相比，*P<0.05，**P<0.01

组 别例数21号染色体异常(三体+单体)21三体21单体总例数患者平均年龄例数患者平均年龄例数患者平均年龄自然妊娠流产组2696(2.23)32.17±4.546(2.23)32.17±4.540—辅助生殖流产组23213(5.60)∗32.62±4.639(3.88)32.00±5.104(1.72)34.00±3.56

注：与自然妊娠流产组比较，*P<0.05

表3 流产组织染色体异常与不同妊娠方式及年龄的关系[(-±s)， n(%)]

注：与辅助生殖流产组比较，aP<0.001；与同组≥35岁患者相比较，bP<0.01，cP<0.001

讨 论

促排卵和配子及胚胎的体外操作是ART的主要组成部分。理论上，长时间和超生理剂量的外源性促性腺激素的使用可能会增加卵母细胞在第一次减数分裂时对环境的敏感性，使微管的机能失调，并且可能使质量低下、本应该闭锁的那部分卵母细胞因为卵巢刺激越过主导卵泡的自然选择过程而被募集[3]。这些均可能会引起DNA的复制错误、DNA不稳定、减数分裂过程异常及姐妹染色单体交换频率增加[4]。而实际上Meta分析的结果表明ART技术不会增加染色体非整倍性的发生[5]。本研究结果显示，494例自然妊娠流产患者与396例辅助生殖妊娠流产患者的染色体异常发生率及性染色体组成情况并无显著差异(P均>0.05)，这与Meta分析结果一致。

两组患者中，辅助生殖流产患者平均年龄以及流产孕周大于自然妊娠流产患者，这与ART患者人群的特殊性相关。可能原因：(1)此类患者一般都经历了自然妊娠失败，反复早期流产或不良孕产史，在不断尝试而未获得健康婴儿出生的情况下，再来寻求辅助生殖技术助孕，势必平均年龄偏大；(2)患者通过ART助孕成功后，临床上通常会采用孕激素及雌激素类药物对珍贵儿进行保胎，使得不可避免的流产的发生有所滞后，因此造成流产的平均孕周偏大。

所有研究对象中非整倍性流产组织共计501例，从染色体异常类型上来看，单一染色体异常占比最高，达76.25%。其中，16号染色体异常发生率最高(26.70%)，其后依次是22号、X、15号、13号、21号染色体异常，这与文献结论一致[6-7]。

比较不同妊娠方式流产组织染色体异常占比，辅助生殖妊娠流产组69，XXN占比显著低于自然妊娠流产组(0.86% vs.4.83%，P<0.01)。69，XXN胚胎的可能形成机制有如下几点：(1)2条精子进入卵母细胞；(2)二倍体的精子进入卵母细胞或者1个正常的精子进入二倍体的卵母细胞；(3)卵母细胞内第2极体滞留以致形成2个雌原核和1个雄原核；(4)原核碎裂[8]。其中最常见的原因是2条精子进入卵母细胞，即3PN胚胎。辅助生殖技术可以识别3PN胚胎并不予移植，这排除了大部分69，XXN胚胎临床妊娠的机会，而对于其他可能的形成因素，辅助生殖技术并不能很好的避免。因此，本研究中辅助生殖妊娠流产组织中仍有2例69，XXN核型。相比辅助生殖妊娠，自然妊娠状态下机体并不能识别原核期3PN胚胎，而3PN往往不影响胚胎的早期发育，这可能是自然妊娠流产组织中69，XXN胚胎稍微多见的原因。

此外，辅助生殖妊娠流产组21号染色体异常占比高于自然妊娠组(5.60% vs.2.23%，P<0.05)。21号染色体异常中包含21三体异常与21单体异常。辅助生殖妊娠流产组21三体占比虽然高于自然妊娠流产组，但并无显著差异(P>0.05)。值得关注的是，21单体是辅助生殖妊娠流产组中的特有现象。文献显示，有25%～30%的人类未受精卵为非整倍性，这类卵母细胞在自然妊娠或IVF助孕中不能受精，而ICSI技术的出现可能会促进异常卵母细胞的受精[9]。这可能是因为，在自然妊娠中21号染色体缺失的卵母细胞与染色体正常精子相结合，或者染色体正常的卵母细胞与21号染色体缺失的精子相结合，均会出现受精障碍，不能形成临床妊娠，因此自然妊娠流产组的流产组织检测结果中无21单体异常。而同样的精子或卵母细胞异常情况，ICSI技术能够帮助精卵突破受精障碍，使得21单体的胚胎继续发育，甚至实现临床妊娠，但最终难逃流产的命运，因此在辅助生殖妊娠流产组的流产组织中可见21单体异常。本研究结果显示，4例21单体流产的辅助生殖妊娠患者，均是通过ICSI技术助孕成功妊娠的，这在一定程度上验证了这一可能原因。

女性年龄与卵母细胞质量有密切关系。女性在35岁之后受孕率开始下降，流产率开始上升。主要原因是35岁以后卵母细胞染色体非整倍性概率明显增加[10]。因此，35岁成为高龄孕妇的界定标准[7]。本研究中，将不同妊娠方式流产患者以35岁为界，细分为<35岁和≥35岁两个亚组。结果显示，四组之间染色体非整倍性发生率的显著差异来源于患者年龄，与妊娠方式无关。意味着患者年龄越大，染色体非整倍性发生率越高。单独分析染色体异常的高发类型，22号染色体异常、≥2条染色体异常在高龄患者流产中高发。Pylyp等[11]发现<25岁时流产绒毛染色体异常占比为46.4%，而>40岁时流产绒毛染色体异常占比增长为63.2%。Dai等[12]发现女性年龄≥40岁时，胎儿染色体异常占比达60.61%，且伴随3次自然流产史的高龄女性，其胎儿染色体异常数目也会增加。母亲年龄是迄今唯一被证实的与生殖细胞非整倍体发生密切相关的因素。大于35 岁女性卵母细胞的染色体非整倍体率明显上升，这可能与高龄女性卵母细胞减数分裂重组错误、纺锤体聚合检验点蛋白缺陷和cohesion 蛋白减少等有关[13-14]。但并不是所有染色体异常都与女性年龄相关[15]。本研究结果显示，15号染色体和Turner综合征与女性年龄并不相关，而16号染色体异常更好发于低龄流产患者。形成这些差异的遗传基础尚不明确，有可能与父方年龄相关，也有可能与外界环境影响相关，仍需进一步研究分析。

总的来说，通过本中心辅助生殖妊娠流产患者与自然妊娠流产患者的数据分析，发现辅助生殖妊娠组流产组织染色体的非整倍性并未增加，说明我中心并没有因为促排卵不当增加胚胎染色体非整倍性的发生率。但是两种妊娠方式在个别染色体异常占比以及染色体异常类型中表现出了统计学差异。我们认为21号染色体异常在辅助生殖妊娠流产组中占比增加，可能与ICSI技术操作导致21单体增加相关；22号染色体异常及≥2条染色体异常在辅助生殖妊娠流产组中高发，可能与辅助生殖人群年龄偏大相关，且辅助生殖人群合并有各种不孕因素，这也可能是流产发生的诱因[16]，我们将在以后的研究中进一步分析讨论。