TMEM67基因突变所致的Joubert综合征一家系及临床遗传学分析

李陈 魏然 王逾男 何薇 赵馨 丁红珂 杨朝湘 卢建 尹爱华*

(1.广东省妇幼保健院 医学遗传中心，广东 广州 510010；2.广东省妇幼保健院 医学影像科，广东 广州 510010)

Joubert综合征(MIM213300)是一种罕见的以小脑蚓部发育不良(中-后脑畸形)伴发作性呼吸过度、眼球运动障碍、共济失调和智力低下为主要特征的神经系统发育障碍性遗传病，也常与肾脏及肝脏等内脏发育异常相关[1]。Joubert综合征的主要遗传方式为常染色体隐性遗传，少部分为X连锁隐性遗传。它的典型神经影像学表现为“磨牙征”[2]。Joubert综合征的发病率低，在活产儿中约为1/100 000～1/80 000[3]。由于Joubert综合征存在临床表现的异质性及致病基因的不明确性，Sanger测序不适用于Joubert综合征的基因诊断。在二代测序技术(next-generation sequencing，NGS)的推动下，全外显子高通量测序技术发展迅速，NGS可以通过反复测序同一区域的DNA片段，达到很高的灵敏度和准确度，同时能在很短的时间内完成上百亿碱基的测序，效率高，为基因组分析提供了新的方法[4]。本研究利用全外显子高通量测序技术对一Joubert综合征家系进行突变基因检测，并对检测到的突变位点进行Sanger测序验证，不仅成功鉴定了一种导致Joubert综合征的新突变，丰富了Joubert综合征的病因信息，同时为罕见疾病的产前诊断及临床确诊提供了一套可行的新方法。

1 材料与方法

1.1 病历资料 穆某某，40岁，因“外院超声发现胎头变形、双肾增大、羊水过少”于广东省妇幼保健院产前诊断中心就诊。既往史：G5P1A3，既往3次均因“胎儿双肾异常、羊水过少”引产，引产后未行进一步检查。自然流产1次，2006年剖宫产一女婴，健存。现为第5次怀孕，2015年11月11日本院Ⅲ级超声提示：孕25+周，胎儿双侧多囊肾声像，严重羊水过少，Dandy-Walker变异型(图1)。本院MRI提示：胎儿小脑蚓部显示不明确，轴位上中脑层面可见“臼齿征”，双侧小脑上脚增粗；第四脑室增宽扩大，并与后颅窝池相通。多拟Joubert综合征畸形改变(图2)。双侧侧脑室及后颅窝池轻度增宽，双侧婴儿型多囊肾，羊水过少。入院诊断：①胎儿异常；②羊水过少；③遗传咨询(不良孕产史)；④高龄孕产妇妊娠监督；⑤瘢痕子宫。本研究家系既往无遗传病家族史，非近亲婚配，夫妇双方均体健。经遗传咨询，夫妻双方知情选择行产前诊断(羊水)，行胎儿染色体分析、微阵列分析及全外显子测序检查；夫妇双方同时行外周血染色体测序分析，测序结果均经Sanger测序验证。测序及Sanger验证结果显示存在致病基因位点，夫妇双方要求引产并行胎儿尸检。本研究家系既往无遗传病家族史，非近亲婚配，夫妻双方均体健。本研究获得了广东省妇幼保健院机构审查委员会及广州医科大学伦理委员会的批准。所有样品的采集均取得了参与者的书面知情同意书。

图1胎儿Ⅲ级超声图像(左图：脑部Dandy-Walker变异型；右图：多囊肾)

图2 胎儿头颅磁共振图像(小脑蚓部“臼齿征”)

1.2 实验方法

1.2.1 羊水及外周血DNA提取 用QIAGEN公司基因组DNA提取试剂盒QIAGEN DNA Blood Mini Kit按试剂盒说明书提取羊水及外周血DNA，使用Nanodrop2000超微量分光光度计进行提取DNA的定量。

1.2.2 羊水培养及染色体核型分析 常规操作进行羊水细胞原位培养、收获、制片和G显带，全自动扫描仪扫描、拍照。按照人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2009)标准进行G显带染色体核型分析诊断。必要时加做C显带、N显带；

1.2.3 羊水染色体微阵列分析及QF-PCR分析 羊水DNA使用Agilent公司生产的的芯片进行全基因组扫描检测，数据分析参照DECIPHER、ISCA、0MIM、DGV、UCSC等数据库。胎儿取材母血DNA污染鉴定结果：D13S305、D18S978、D21S11等11个STR位点测序分析提示无母体DNA污染。

1.2.4 羊水DNA二代测序 定制罗氏NimbleGen全外显子捕获探针对全外显子区域DNA捕获并富集，使用illumina HiSeq2500(Illumina, SanDiego，CA，USA)进行高通量测序。数据分析：①基本信息分析：去接头污染，去低质量后进行原始数据产量统计；②使用BWA比对软件，将数据与参考序列进行比对统计；③根据测序深度、突变质量，对检测得到的SNP进行过滤筛选，得到高质量可靠的突变谱；④筛选出的变异对蛋白功能影响的预测：使用sIFT、Plovphen-2、Mutation Taster等基于同源比对，蛋白结构的保守性等的算法，预测筛选出的变异对蛋白质的影响。

1.2.5 Sanger测序 根据高通量测序结果用Sanger测序对羊水细胞DNA及父母外周血DNA进行突变位点的检测和验证。采用Primer5软件设计引物，扩增TMEM67基因第12个外显子序列。引物序列为：TMEM67-E12F：GGGATAAACAAGGTAGTATAAAGACATT，TMEM67-E12R：GGG-TCTAAGTCCACCAGCAAT。PCR扩增条件为：95℃5 min，95℃30 s、，58℃30 s，72℃5min、，72℃30 s，共进行38个循环反应。

2 结果

2.1 脐血染色体核型与染色体微阵列分析 胎儿羊水染色体及微阵列分析未见异常。

2.2 二代测序结果分析 胎儿脐血测序及Sanger验证结果显示：TMEM67基因第12个外显子上发生了双重错义突变，位点分别为c.1175C>G及c.1250A>G。其中c.1175C>G来源于父亲，c.1250A>G 来源于母亲 (图3)。Mutation Taster根据遗传方式及家系中分布情况推测该位点为疾病相关变异，相关数据库及文献未见报道。TMEM67基因突变与Joubert综合征6型相关，为常染色体隐性遗传。临床主要表现为精神运动发育迟缓、小脑蚓部发育不良引起的共济失调、肾囊肿、视网膜发育不良等。

图3 TMEM67基因Sanger测序峰图A、B.胎儿脐血TMEM67基因；C.母方外周血TMEM67基因；D.父方外周血TMEM67基因

2.3 引产后胎儿尸检结果分析 引产后胎儿尸检结果提示：胎儿小脑蚓部完全缺如，心脏室间隔缺损，双肾发育不良伴多囊肾。符合胎儿Joubert综合征，符合产前诊断的结果。

3 讨论

Joubert综合征(Joubert syndrome，JBTS，213300)是一种常染色体隐性遗传病，以小脑蚓部发育不全为特征，伴有低张力、发育迟缓、呼吸模式异常和眼球运动异常。枕叶脑膨出和多指畸形偶有报道。临床上Brancati等人[5]将Joubert综合征是否合并其他异常分为6型，即单纯型Joubert综合征、Joubert综合征合并眼部异常、Joubert综合征合并肾脏异常、Joubert综合征合并眼肾异常、Joubert综合征合并肝脏异常、Joubert综合征合并口面指畸形。目前遗传学上根据致病基因不同又将Joubert综合征分为35种，TMEM67基因异常导致的Joubert综合征属于基因分型JBST6型，约占Joubert综合征的6%～10%[6]。

本文我们描述了一对非近亲婚配的夫妇，共怀过4次产前超声异常的胎儿。前三胎均在外院行产前检查，提示有“双肾增大、羊水过少”，未行染色体及基因检测。第5胎在本院产前超声诊断为脑部Dandy-Walker变异型及双侧多囊肾声像、严重羊水过少，胎儿脑部MRI见特征性“臼齿征”，怀疑Joubert综合征。当产前超声及MRI发现胎儿结构异常时我们首选染色体核型及微阵列技术检测，因此本文中进行了羊水核型及微阵列检测，结果均为正常。同时根据胎儿特征性Joubert综合征可疑脑部异常征象，我们进行了羊水全外显子测序，发现了一种TMEM67基因的新型双重杂合突变(c.1175C>G及c.1250A>G)，且这两种杂合突变分别遗传自父母，同时表型正常的大女儿仅为杂合子。这两种杂合突变类型均未被报道过，且此两个变异位点均可引起编码氨基酸的改变。结合该病遗传特性、受检胎儿临床资料及家系基因检测结果，强烈提示两个变异位点为疾病相关变异[7]。因此，我们考虑TMEM67基因的双重杂合突变(c.1175C>G及c.1250A>G)为异常胎儿的致病原因。

基因TMEM67(NC_000008.11)位于染色体8q21.13-q22.1位置，全长约12.67Mb，由Smith[8]2006年在大鼠中发现。人TMEM67基因编码一种由995个氨基酸组成的蛋白质，称为Meckelin蛋白，蛋白质量约108KD，与大鼠Meckelin蛋白有84%的同源性。2007年Baala等人[9]首次在一个近亲家庭中发现TMEM67基因异常导致的JBST6，这个家庭两次妊娠都因“超声发现胎儿后颅窝异常及肾脏”增大于孕晚期引产，夫妇双方携带了两种不同的TMEM67基因突变并遗传给胎儿。后Dawe等人[10]2007年利用原位杂交技术在人类胚胎中发现，Meckelin蛋白在肾、肝、视网膜、后脑、蝶骨和脑中线均有表达。在发育中的肢体软骨中也有很强的表达，尤其是在指(趾)软骨中。同时他们利用免疫组化技术发现，18～20周龄人胎儿肾脏在近端肾小管上皮细胞中检测到中等至高表达的Meckelin蛋白。

TMEM67基因缺陷可导致多种综合征，包括RHYNS 综合征、COACH 综合征，Joubert综合征6型(JBST6)，Meckel-Bruber综合征3型(MKS3)，Bardet-Biedl综合征14型等。由TMEM67基因异常导致的JBST6型往往伴有视网膜营养不良与肾脏异常。2009年Otto等人[11]在120例无血缘关系JBST患者中发现4例(3.3%)为TMEM67突变引起。4例患者均有共济失调、低张力或精神运动迟缓或小脑蚓部发育不良。且4例患者均在8～15岁期间出现终末期肾病、肝纤维化，同时也有眼部受累，包括失明、视网膜退行性变或视网膜色素瘤。2013年Du E等人[12]研究表明，TMEM67基因可通过激活ERK和JNK依赖的信号通路导致肾脏疾病的发生。本文中胎儿出现的主要表现为典型的JBST表现脑部“臼齿征”及肾脏异常改变，符合TMEM67基因异常引起的JBST6型特征。

通过二代测序技术，我们发现了疾病相关的异常基因改变。随着基因技术的发展，产前诊断越来越多地采用更先进的分子遗传学检测技术，如CMA和NGS。2018年，ISPD SMFM和PQF就基因测序用于胎儿诊断发表了联合声明，内容包括：对于CMA等公认检测方法无法提供有效信息的胎儿，目前可采用测序诊断技术进行胎儿评估[13]。与该声明一致，我们首先采用染色体核型和CMA辅助产前诊断，最终通过二代测序技术确认了TMEM67的新发复合杂合突变为致病原因。本文表明二代测序技术是对产前诊断十分有帮助和有效的检查，特别是对于临床鉴别诊断模糊的胎儿。为NGS应用于产前诊断的适用性提供了有力证据。同时，此TMEM67的复合杂合突变为首次发现且与JBST6相关，这不仅帮助家庭确定和避免未来妊娠的复发风险，同时更对这种罕见疾病提供了更多的基因诊断信息和有更深刻的了解。

综上所述，我们利用二代测序技术首次发现了一种TMEM67新发复合突变(c.1175C>G合并c.1250A>G)，并且根据基因检测结果及基因型-表型分析，确认此突变为上文所述家系的遗传学病因。后我们的研究表明，二代测序技术是一个能够有助于诊断胎儿产前超声检查异常的遗传学病因的有效技术。在成功找到遗传学病因后，可在下一次生育实现妊娠早期产前诊断及知情选择PGD有效避免罕见遗传病的发生。同时我们发现了Joubert综合征的一种新发复合突变，丰富了Joubert综合征的基因信息。