银屑病患者血清miR-146a和miR-125b水平检测及临床意义

张梁宇 单浩 朱晓杨 孙颖 陈杨

银屑病是一种常见的皮肤自身免疫性疾病,影响了约3%的世界人口,对全球>3%人群的生活质量产生了重大的负面影响[1-2].其特点是角质化细胞的增殖和异常分化,以及淋巴细胞和中性粒细胞的浸润[3].遗传、免疫、传染性和代谢紊乱都是银屑病的病因[4].然而,银屑病的确切发病机理尚不完全清楚.通过寻找特征性生物标记物,准确地预测疾病的进展和治疗效果是目前银屑病研究的热点[5].微小RNA(microRNA)是种由高度保守的小非编码RNA组成的大家庭,其通过调节转录后的基因表达来调节不同的生物过程.有研究提示,miR表达异常在一些皮肤病(如银屑病、狼疮等)疾病发生发展过程中发挥重要作用[6].一些与银屑相关的miR被认为是导致银屑病的发展的原因,运用miRNA芯片技术检测银屑病血清中miR的表达情况,发现miR多个在银屑病的皮肤上有2~42倍的差异[7].通过使用生物信息学方法,作者发现miR-146a和miR-125b在银屑病患者血清中表达水平发生了显著差异.基于上述发现,本研究检测银屑病患者血清中miR-146a和miR-125b表达水平,并进一步评估了银屑病的临床严重程度,为寻找银屑病病情严重程度及疗效评估潜在的生物学标志物提供依据.

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年6月至2018年6月在本院皮肤科就诊的门诊和住院寻常型银屑病患者72例作为银屑病组,男39例,女33例,平均年龄(38.22±8.41)岁.其中进行期27例、静止期22例、退行期23例.纳入标准:(1)所有患者符合《中国银屑病治疗专家共识(2014版)》中寻常型银屑病诊断标准[8];(2)所有患者近2个月未接受系统治疗;(3)没有使用免疫抑制剂、维A酸和糖皮质激素等药物治疗;(4)所有患者及(或)家属对本研究知情同意并签署知情同意书.排除标准:(1)银屑病合并其他免疫系统疾病患者;(2)不能配合检测患者;(3)患有严重肝、肾、心疾病患者.同时选择本院同期进行健康体检者70例作为对照组,男36例,女34例,平均年龄(35.57±4.67)岁.两组观察对象临床资料比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性.本研究获得医院医学伦理学委员会批准.

1.2 银屑病皮损面积和严重程度评分法(PASI)评分[9]皮损严重程度为红斑(E)、鳞屑(D)和浸润程度(I)的评分相加,上述病变按轻、中、重、极重度分别记1~4分,没有病变记为0分.根据身体各部位皮损面积评分计数PASI,PASI=头部积分X(E+D+I)X0.1+上肢积分X(E+D+I)X0.2+躯干X(E+D+I)X0.3+下肢积分X(E+D+I)X0.4,各症状积分除以2,总分为72分.所有患者由具有高年资医生进行PASI评定.

1.3 实时荧光RT-PCR(RTFQ-PCR)法检测血清中miR-146a和miR-125b的水平 采集清晨空腹静脉血5ml,加入TRIzol 1ml后-80℃保存,备用;取出保存的加TRIzol全血,根据RNA提取试剂盒(美国Life Technologies公司)操作说明书提取RNA,根据Taq Man microRNA反转录试剂盒(美国ABI公司)说明合成cDNA,将cDNA置于-20℃保存备用.根据SYBR Premix Ex Taq TM II荧光定量PCR试剂盒(上海生工生物工程有限公司)说明进行PCR扩增.miR-146a引物序列:上游引物为5'-GCAGCACGCTAGGTAGTTTCC-3',下游引物为5'-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTGAC-3';miR-125b引 物 序 列:上 游 引 物 为5'-GCAGCACGCTAGGTAGTTTCC-3',下游引物为5'-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTGAC-3';GAPDH引物序列:上游引物为5'-TCCCATCACCATCTTCCAG-3,下游引物为5-GGTATCCATCGCCATGCTC -3'.每个标本做3个复孔.用实时荧光定量PCR仪检测对其表达量进行结果分析,以GADPH作为内参,采用 2-△△Ct法计算mRNA 的相对表达量.

1.4 miR微阵列分析 从所合成的cDNA中随机选择银屑病组和对照组各4例进行miR微阵列分析.将cDNA进行poly A加尾Mix和进行生物素标记,然后杂交至芯片上,进行清洗和染色后用Affymetrix扫描仪3000扫描阵列,使用GeneChip miRNA2.0阵列检测miR的表达.

1.5 统计学分析 采用SPSS19.0统计软件.计量资料以(±s)表示,分析前进行正态检验,若满足正态性,用单因素方差分析进行判断;若不满足正态性,数据转换后再进行分析.采用pearson进行miR-146a和miR-125b与PASI相关分析,P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 银屑病组和对照组之间miR表达差异 对8个样本进行miR微阵列分析(银屑病组和对照组各4个),银屑病患者中发现39个miR表达水平显著不同,其中26个miR表达上调,13个表达下调.

2.2 两组观察对象血清中miR-146a和miR-125b的表达水平的比较 见表1.

表1 两组观察对象血清中miR-146a和miR-125b的表达水平的比较(±s)

表1 两组观察对象血清中miR-146a和miR-125b的表达水平的比较(±s)

分组 miR-146a miR-125b银屑病组(n=72) 5.74±0.07 0.35±0.04对照组(n=70) 1.00±0.09 1.00±0.02 t值 54.779 65.658 P值 0.000 0.000

2.3 不同程度银屑病患者血清中miR-146a和miR-125b的表达水平的比较 见表2.

表2 不同程度银屑病患者血清中miR-146a和miR-125b的表达水平的比较(±s)

表2 不同程度银屑病患者血清中miR-146a和miR-125b的表达水平的比较(±s)

注:与进行期比较,*P<0.05;与静止期比较,#P<0.05

分组 miR-146a miR-125b进行期(n=27) 1.00±0.10 1.00±0.07静止期(n=22) 0.53±0.09* 2.48±0.07*退行期(n=23) 0.20±0.07*# 4.55±0.12*#F值 127.650 286.560 P值 0.000 0.000

2.4 银屑病患者血清中miR-146a和miR-125b的表达水平与PASI评分相关性分析 经检验各组数据符合正态分布,用pearson线性相关进行分析,银屑病患者PASI评分与血清中miR-146a的表达水平呈正相关(r=0.510,P=0.026);银屑病患者PASI评分与血清中miR-125b的表达水平呈负相关(r=-0.417,P=0.038).见表3.

表3 银屑病患者血清中miR-146a和miR-125b表达水平与PASI评分相关性分析(n=72)

3 讨论

近年来,许多研究集中在miR与各种人类疾病的发展之间的关系,包括皮肤病.银屑病是成人的慢性炎性皮肤病,然而难以治疗和评估.既往对银屑病的研究主要以皮肤作为标本进行相关检测,但皮肤受到取材部位的代表性和患者的接受意愿等问题,受到一定的限制[10].而在对miR-369-3p的研究发现,患者血清和皮肤样本中miR-369-3p水平无显著相关性,这可能是由于miR-369-3p不仅从银屑病灶的角化细胞和炎性细胞分泌,而且外周血单核细胞也能分泌有关[11].因此,本研究采用血清作为研究标本,对银屑病患者和健康对照者中miR-146a和miR-125b mRNA表达进行了综合分析.

既往研究通过对miR表达系统分析,证实了银屑病皮肤中存在大量调控失调的miRNA[12].在银屑病患者中,miR-203的过表达可能通过抑制细胞因子信号转导因子3(SOCS-3)的抑制因子而增加皮肤炎症反应.miR-146a和miR-125b已参与调节先天免疫反应,miR-146a表达上调能够抑制TNF-α信号通路,调节靶基因TRAF6和IRAK1的表达.与之相反,miR-125b表达下调可能增强TNF-α的表达,促进皮肤炎症的发展.Pivarcisi等[13]研究发现,与健康对照组比较,银屑病患者血清中miR-128a、miR-142-3p、miR-181a和let-7d表达下调,miR- 223和miR- 143显著上调.本研究进行miR微阵列分析发现,银屑病患者中39个miR表达水平显著不同,其中26个miR表达上调,13个表达下调.在39种失调的miR中,有几种miR被报道与银屑病或其他炎症性疾病的失调.例如,银屑病患者角质形成细胞中miR-31上调,通过靶向丝氨酸/苏氨酸激酶调控细胞因子表达[14];在银屑病皮肤中miR-99a和miR-200c下调,miR-99a可以通过上调IGF-1R的表达调节角质形成细胞的分化[15];miR-192上调抑制巨噬细胞,使MIP-2α表达下降,MIP-2α参与肠道炎症疾病的发展.本研究结果显示,银屑病组血清中miR-146a表达增高,miR-125b表达降低,且随着银屑病病情的好转,miR-146a下调和miR-125b上调幅度更显著.本研究不仅调查了银屑病患者血清中miR-146a和miR-125b表达的水平,还评估了它们与患者PASI评分的相关性.结果显示,银屑病患者PASI评分与血清中miR-146a的表达水平呈正相关,与miR-125b的表达水平呈负相关.因此,将血清中miR-146a和miR-125b作为诊断银屑病的潜在标志物是合理的.本研究也通过生物信息学分析和文献综述,发现7个与银屑病相关基因被预测为miR-146a和miR-125b的靶基因,包括TNF-α、LIMK1、SIRT1、SP3、ADAM10、hes1和 WNT5A.其中,TNF-α被报道为直接作用于角质形成细胞的重要致病性细胞动力学因子,诱导多种趋化因子的产生,并参与白细胞介素介导进入银屑病病变.由于本研究设计初始阶段无法确定与银屑病相关的miR,因此无法对靶基因水平进行检测,导致靶基因实验数据的缺失,使本研究的结果推广受到限制,后续将完善相关研究.

综上所述,银屑病血清中miR-146a水平升高、miR-125b水平降低,且二者的表达水平与银屑病的严重程度密切相关,有可能作为判断银屑病病情严重程度及疗效评估潜在的生物学标志物.由于本研究样本量和代表性等的局限性,同时未对miR-146a和miR-125b的靶基因进行研究,其结果推广应用有待进一步的研究.