黄酒贮藏过程中生物胺变化规律的研究

何晨怡，童琳娜，王楠，*，王伟，谢广发，金建昌

（1.浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江杭州310015；2.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江杭州320021）

生物胺是一类低分子量含氨基化合物的总称，可看作是氨分子中1 个至3 个氢原子被烷基或芳基取代后而生成的物质，是脂环族或杂环族的低分子量有机碱。当人体摄入过量时，会引起头疼、恶心、心悸、血压变化、呼吸紊乱等过敏反应，严重时可能危及生命[1]。生物胺主要有两种合成途径：一是通过机体细胞代谢，二是通过脱羧酶对游离氨基酸的脱羧作用[2]。食品中的生物胺主要来源于游离氨基酸在氨基酸脱羧酶作用下脱去羧基形成的产物，部分生物胺可经过醛酮的胺化作用形成[1-2]。生物胺广泛存在于富含氨基酸、蛋白质的水产品[3]、肉制品[4]，尤其是发酵香肠[5]、火腿[6]、干酪[7]、黄酒、葡萄酒、啤酒等发酵加工食品[8-11]。单胺氧化酶的活性因酒精和乙醛的抑制，从而提高人体对生物胺的敏感性，降低了组胺等生物胺产生危害作用的剂量，因此，发酵型酒中生物胺安全性尤其是组胺限量问题备受关注。李妍等[12]研究生物胺和氨基酸含量对黄酒产地判别的影响，证实组胺与氨基酸密切正相关，并建立了可以区分不同产地黄酒的模型。王瑞等[13]研究不同产区葡萄酒中生物胺含量，发现各产区酒中腐胺和尸胺含量稳定，亚精胺在部分样品中未检出。李志军等[14]对250 种国产葡萄酒中8 种生物胺的组成与并分析其含量进行研究，发现干红葡萄酒样品中生物胺含量较高。

黄酒也是发酵酒之一，由于发酵酒酿造工艺的特殊性，在加工过程中氨基酸极易脱羧形成生物胺，生物胺过量尤其是组胺会危害人体健康，因此对于发酵食品有着严格的限量标准。部分国家已制定了葡萄酒中组胺限量：如澳大利亚、匈牙利和瑞士限量为10 mg/L，法国限量为8 mg/L，比利时限量为5 mg/L～6 mg/L，荷兰限量为3 mg/L，德国限量为2 mg/L[15]。现今中国对发酵食品的中生物胺均未有国家限量标准[16]，黄酒中生物胺的限量也还未有明确规定。关于不同产地类型的成品黄酒贮藏过程中生物胺的动态变化研究鲜见报道。因此，本试验针对贮藏过程中黄酒中的生物胺的变化规律进行研究，在确定黄酒中生物胺检测方法[17-18]的基础上，研究了不同类型黄酒，不同贮藏条件下5 种生物胺含量的变化规律，并利用反向传播神经网络（back propagation neural network，BPNN）建立黄酒贮藏过程中生物胺含量的动态模型，阐释了黄酒贮藏过程中生物胺含量的动态变化规律，对保障黄酒的优质和安全具有重要的现实意义。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

女儿红、西塘、香雪、上海、善酿5 种成品黄酒（各酒样生产日期一致）：市售；尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺、丹磺酰氯：SIGMA-ALDRICH 试剂公司；乙腈（色谱纯）：美国 TEDIA 公司；氨水（NH4OH）：国药集团化学试剂有限公司；水为超纯水。

1.2 仪器与设备

液相色谱仪（FL2000）：浙江温岭福立分析仪器有限公司；电子分析天平（PL303）：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；智能人工气候箱（RXM-80A）：宁波江南仪器厂；台式高速冷冻离心机（Biofuge Prino R）：德国贺利氏公司；数显恒温水浴锅（HH-4）：常州市金坛友联仪器研究所；超声波清洗仪（KQ3200E）：上海珂淮仪器有限公司；Symmetry Shield RP18 色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）：美国沃特世公司。

1.3 试验方法

1.3.1 成品黄酒取样

5 种成品酒分别置于25、37 ℃贮存条件下，前10 d每2 d 取样一次，后20 d 每5 d 取样一次，共30 d。

1.3.2 高效液相法定量分析生物胺

参照陆永梅等[17]的方法，样品以丹磺酰氯[18]衍生，流动相采用水和乙腈，高压梯度洗脱，流速0.8 mL/min，紫外检测波长254 nm，进样量10 μL。

1.3.3 数据处理

应用MATLAB R2017b 软件的Neural Net Fitting来建立神经网络，并验验证其准确性。Origin Pro 9.0 软件作图。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的线性方程、相关系数、回收率试验

以5 种生物胺混标溶液进行线性试验，浓度分别为 2、5、10、20、40 g/mL，衍生、测定并制作标准曲线进行线性回归计算，结果见表1。

表1 HPLC 法测生物胺的线性方程、相关系数、回收率结果Table 1 Linear equation，goodness of fit and recovery of BA determined by HPLC

由表 1 可见，5 种生物胺在 2.00 mg/L～40.00 mg/L线性范围内呈良好线性相关，拟合优度均大于0.995。5 种生物胺的平均回收率均在96%～104%之间，可见该方法回收率较高，可靠性强。整个贮藏过程中亚精胺和精胺均低于检出限。

2.2 25℃贮藏过程中生物胺的含量变化规律

25 ℃贮藏条件下，5 种成品黄酒中5 种生物胺含量的变化规律见图1～图5。

图1 25 ℃贮藏条件女儿红黄酒中生物胺变化情况Fig.1 Changes of BA in Nüerhong yellow rice wine stored at 25 ℃

图2 25 ℃贮藏条件西塘黄酒中生物胺变化情况Fig.2 Changes of BA in Xitang yellow rice wine stored at 25 ℃

图3 25 ℃贮藏条件上海黄酒中生物胺变化情况Fig.3 Changes of BA in Shanghai yellow rice wine stored at 25 ℃

图4 25 ℃贮藏条件香雪黄酒中生物胺变化情况Fig.4 Changes of BA in Xiangxue yellow rice wine stored at 25 ℃

图5 25 ℃贮藏条件善酿黄酒中生物胺变化情况Fig.5 Changes of BA in Shanniang yellow rice wine stored at 25 ℃

如图1 所示，女儿红黄酒中检出酪胺、尸胺、组胺，25 ℃贮藏条件下贮藏4 d 后，生物胺总含量高达28.86 mg/L，主要生物胺为酪胺，占生物胺总量85.83%；其次为尸胺，占总含量7.80%。随贮藏时间的延长，生物胺总量呈先上升后下降复上升的趋势。如图2 所示，西塘黄酒中检出生物胺为酪胺和尸胺，生物胺总含量变化不显著，在6.51 mg/L～8.11 mg/L 范围内。如图3 所示，上海黄酒检出生物胺为酪胺和尸胺，酪胺含量在前10 d 贮藏过程中由0 mg/L 迅速升至4.00 mg/L，随后趋于稳定，酪胺占生物胺总量85.47%。如图4 所示，香雪黄酒检测中主要生物胺为尸胺，生物胺总含量变化不明显，在0.65 mg/L～1.01 mg/L 范围内，贮藏至8 d 时出现峰值1.01 mg/L，随后缓慢下降，30 d 时降至0.65mg/L。如图5 所示，善酿黄酒中检出生物胺，主要为尸胺，生物胺总含量不明显，在0.68 mg/L～1.02 mg/L范围内。

25 ℃贮藏条件黄酒中生物胺总含量变化情况见图6。

图6 25 ℃贮藏条件黄酒中生物胺总含量变化情况Fig.6 Changes of total BA content in yellow rice wine stored at 25 ℃

如图6 所示，女儿红、西塘、上海黄酒生物胺总含量相对香雪、善酿黄酒中生物胺总量较高，并随着贮藏时间的延长，呈上升趋势。女儿红黄酒生物胺总含量最大达28.86 mg/L。香雪、善酿黄酒中生物胺总量在0.67 mg/L～4.68 mg/L 范围内。

25 ℃条件下贮藏，尸胺的含量随着贮藏时间的延长呈下降趋势，女儿红黄酒中尤其显著；酪胺在香雪、善酿黄酒中未检出，在女儿红、西塘、上海黄酒中的含量随贮藏时间逐渐上升，尤其是女儿红黄酒中的酪胺含量最高达23.35 mg/L；组胺仅在女儿红黄酒中检出，含量变化不显著，在1.63 mg/L～4.03 mg/L 范围之间。

2.3 37℃贮藏过程中生物胺的含量变化规律

37 ℃贮藏条件下，5 种成品黄酒中5 种生物胺含量的变化规律见图7～图11。

图7 37 ℃贮藏条件女儿红黄酒中生物胺变化情况Fig.7 Changes of BA in Nüerhong yellow rice wine stored at 37 ℃

图8 37 ℃贮藏条件西塘黄酒中生物胺变化情况Fig.8 Changes of BA in Xitang yellow rice wine stored at 37 ℃

图9 37 ℃贮藏条件上海黄酒中生物胺变化情况Fig.9 Changes of BA in Shanghai yellow rice wine stored at 37 ℃

图10 37 ℃贮藏条件香雪黄酒中生物胺变化情况Fig.10 Changes of BA in Xiangxue yellow rice wine stored at 37 ℃

图11 37 ℃贮藏条件善酿黄酒中生物胺变化情况Fig.11 Changes of BA in Shanniang yellow rice wine stored at 37 ℃

如图7 所示，女儿红黄酒主要检出酪胺、尸胺、组胺，均随贮藏时间的延长而上升，在贮藏30 d，生物胺总量高达18.63 mg/L，主要生物胺为酪胺，占生物胺总量71.18%；其次为尸胺，占总含量20.56%。如图8 所示，西塘黄酒中检出生物胺为酪胺和尸胺，酪胺含量随贮藏时间的延长而上升，尸胺含量随着贮藏时间的延长而下降，在贮藏25 d，生物胺总量出现峰值3.64 mg/L，主要生物胺酪胺占总量82.42%。30 d 时生物胺总量降低至3.56 mg/L。如图9 所示，上海黄酒检出生物胺为尸胺，酪胺未检出。尸胺的初始含量为0.95 mg/L，随贮藏时间的延长而含量减少。如图10 所示，香雪黄酒检出主要生物胺为尸胺，生物胺总含量变化不显著，在0.67 mg/L～0.90 mg/L 范围内波动。如图11 所示，善酿黄酒检出主要生物胺为尸胺，生物胺总含量变化不显著，在0.65 mg/L～0.82 mg/L 范围内波动。

37 ℃贮藏条件黄酒中生物胺总含量变化情况见图12。

图12 37 ℃贮藏条件黄酒中生物胺总含量变化情况Fig.12 Changes of total BA content in yellow rice wine stored at 37 ℃

如图12 所示，女儿红、西塘黄酒中生物胺总含量呈上升趋势，其中女儿红黄酒生物胺总含量上升显著，检出最大值为18.63 mg/L。香雪、善酿黄酒中生物胺总含量较低，但均存在上升趋势。随着贮藏时间的延长，女儿红黄酒中尸胺在贮藏15 d 时由1.22 mg/L上升至3.53 mg/L，其余黄酒不显著下降；酪胺在香雪、上海、善酿黄酒中未检出，在女儿红、西塘黄酒中上升趋势明显，尤其是女儿红黄酒中由1.94 mg/L 上升至13.26 mg/L；组胺仅在女儿红黄酒中检出，含量变化不显著，在0.04 mg/L～1.55 mg/L 范围之间。

黄酒酿造是一个开放式的多菌种参与过程，各黄酒酿造工艺存在差异，其中微生物可能含有氨基酸脱羧酶基因，这些脱羧酶即使在细胞死亡后仍具有活性，可以作用于氨基酸从而生成生物胺[19]。由于各类黄酒中微生物的差异，致使不同黄酒的生物胺含量有所差别。黄酒灭菌主要采用柜式灭菌器、薄板式热交换器、列管式热交换器[20]。酒种不同，加热方式各有不同，杀菌温度过高会导致黄酒酒精度下降、口感破坏，故灭菌温度集中在80 ℃～100 ℃，杀菌时间控制在8 s 左右，因此在煎酒过程很难做到完全灭菌。

由于黄酒的酿造工艺存在差异[21]，所以不同黄酒中生物胺的种类有很大不同[22]。参考国家标准GB/T 13662-2018《黄酒》[23]依据含糖量对黄酒的分类，女儿红、西塘、上海属于半干型黄酒，善酿为半甜型黄酒，香雪为甜型黄酒。善酿、香雪黄酒的制作工艺类似，在酿造中均使用其他成品酒代替水作为原料。目的都是为了抑制微生物的糖化发酵，故两种黄酒生物胺含量随时间变化趋势相似。女儿红、西塘、上海黄酒为半干型黄酒，糖分大都已经转化为酒精，只含有少量糖分，但由于其原料、酿造曲种不同[24-25]，其在贮藏过程中生物胺含量变化趋势存在差异。说明，黄酒的生产工艺及贮藏条件均会影响产品生物胺的含量。

2.4 基于BP神经网络对黄酒中生物胺含量预测研究

本研究旨在使用MATLAB R2017b 仿真APP 中的Neural Net Fitting 建立神经网络来预测黄酒贮存中的生物胺含量。由于不同种类酒的糖度不同，进而导致的生物胺的含量存在不同，构建时按酒的分类进行拟合，采用的是糖度为15 g/L～40 g/L 的半干酒样：西塘、上海、女儿红黄酒。

经测试得隐层神经元个数为23 时，相对误差能达到10-10，个别样本相对误差达到150%，故选用23 个神经元来设置隐藏层。半干酒样预测误差分析与对比验证见图13～图14。

图13 误差分析Fig.13 Error analysis

如图13～图14 所示，通过误差分析和比对验证可知，此神经曲线适用于本试验且准确度较高。

3 结论

图14 比对验证Fig.14 Contrast verification

本试验探究了不同贮藏条件下黄酒中生物胺的变化规律。本研究结果表明，37 ℃与25 ℃贮藏条件下，黄酒中生物胺的变化趋势一致。成品酒在25 ℃条件下贮藏，尸胺的含量随着贮藏时间的延长呈下降趋势，女儿红黄酒中尤其显著；酪胺在香雪、善酿黄酒中未检出，在女儿红、西塘、上海黄酒中的含量随贮藏时间逐渐上升，尤其是女儿红黄酒中酪胺含量最高达23.35 mg/L；组胺仅在女儿红黄酒中检出，含量变化不显著，在1.63 mg/L～4.03 mg/L 范围之间。37 ℃贮藏条件下，尸胺的含量随着贮藏时间的延长呈下降趋势；酪胺在香雪、上海、善酿黄酒中未检出，在女儿红、西塘黄酒中上升趋势明显，尤其是女儿红黄酒中由1.94 mg/L上升至13.26 mg/L；组胺仅在女儿红黄酒中检出，含量变化不显著，在0.04 mg/L～1.55 mg/L 范围之间。本试验检测的生物胺总量范围在0.54 mg/L～28.86 mg/L，研究结果对黄酒生物胺含量的安全评价提供数据支持。本试验所得BP 神经拟合曲线准确性与精准性较高，线性回归相关系数R2为0.962 58，所得曲线对黄酒酿造贮藏过程中生物胺的预测有一定的辅助意义。