发酵果汁胶原蛋白饮料的研制及其活性研究*

王少群，邱丹腾，林春通，张红，刘树滔

（1.厦门信道生物技术有限公司，福建 厦门 361026；2.福州大学生物工程研究所，福建 福州 350108）

胶原蛋白的基本结构单元是原胶原，由具有3条左手螺旋α肽链相互缠绕形成的右手螺旋结构的一类蛋白质[1]。因其含量丰富，来源广泛，水解产物具有多种生物活性功能，广泛应用于食品、化妆品、生物医疗等各个领域。

胶原蛋白饮料是通过添加胶原蛋白源（如胶原蛋白、胶原蛋白肽），并对其它各个组分调配形成的一种功能性饮料。对它的研究很多，主要为保健胶原蛋白饮料，如生姜-胶原蛋白[2]、木瓜-胶原蛋白[3]、枸杞子-胶原蛋白[4]、大枣-胶原蛋白[5]等，但多以配方优化为主，鲜有健康功能性研究。通过对京东（https://www.jd.com/）和淘宝（https://www.taobao.com/）的调查，发现胶原蛋白饮料多为果味饮料，产品风味欠佳，功能效果有限。

发酵果汁是由乳酸菌/酵母菌等益生菌对果汁的发酵而形成的营养食品，风味独特，且具有新的营养和保健功能[6]。国内外对发酵果汁饮料的研究很多，主要分为：⑴各种果蔬为主的发酵果汁饮料[7-9]；⑵不同菌种形成的单菌种发酵果汁或多菌种混合发酵果汁饮料[10,11]；⑶搭配药食同源食材的发酵果汁饮料[12,13]；⑷少数搭配动物源食材（如：胶原蛋白）的发酵果汁饮料[14]。然而，通过发酵果汁与胶原蛋白的组合以改善产品风味，提升功能效果的研究较少。

为了使胶原蛋白饮料更容易为市场所接受，本文以胶原蛋白肽为原料，添加发酵果汁和其它辅料，研制口味良好、功能多样的发酵果汁胶原蛋白饮料。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

海娇-胶原蛋白肽冻干粉：购自上海利统生化制品有限公司；保和堂-胶原蛋白果汁饮料：上海葡萄王企业有限公司；天然派-胶原蛋白果汁饮品：深圳市天然派生物科技有限公司；依莲-胶原蛋白液态饮品：上海中邦斯瑞生物药业技术有限公司；益盛汉参-胶原蛋白肽果汁饮品：时代生物科技（深圳）有限公司；Lumi-胶原蛋白液态饮品：大江生医股份有限公司；日本芳珂-胶原蛋白果汁饮料：日本FANCL株式会社。

表1 发酵果汁胶原蛋白饮料配方表 单位：g

发酵红枣浓缩汁、发酵复合莓汁、发酵木瓜汁、发酵苹果汁、发酵柠檬汁、蓝莓浓缩汁、发酵西柚汁、发酵苹果浓缩果汁等：购自福建绿泉食品有限公司。

阿斯巴甜、柠檬酸、苹果酸、果胶、黄原胶等食品添加剂：购自厦门荣新盛食品有限公司；T-AOC试剂盒、总蛋白定量测试盒（双缩脲法）：南京建成生物工程有限公司；其余药品均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

U-1900型紫外-可见分光光度计、CF15RX型高速离心机：日本日立公司；

恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司。

1.3 饮料配方

详细配方见表1。

1.4 方法

1.4.1 饮料的口味确定

1.4.1.1 感官评价方法及标准

评价项目及评价标准见表2，等级划分标准见表3，评价流程如下：

对发酵果汁饮料作随机编号→准备干燥、洁净的杯子对应发酵果汁饮料编号→组织10个人感官评价小组，品尝发酵果汁饮料并作评价。

1.4.1.2 不同品牌胶原蛋白饮料的感官评价

选择6款市面上典型的胶原蛋白饮料作感官评价，分别为：

⑴ 保和堂-胶原蛋白果汁饮料；⑵ 天然派-胶原蛋白果汁饮品；⑶ 依莲-胶原蛋白液态饮品；⑷ 益盛汉参-胶原蛋白肽果汁饮品；⑸ Lumi-胶原蛋白液态饮品；⑹ 日本芳珂-胶原蛋白果汁饮料。

1.4.1.3 不同口味发酵果汁的感官评价

选择5种不同风味的发酵果汁，包括：

表2 感官评价评分标准

表3 感官评价等级划分标准

⑴ 发酵红枣浓缩汁；⑵ 发酵复合莓汁；⑶ 发酵木瓜汁；⑷ 发酵苹果汁；⑸ 发酵柠檬汁。

分别稀释5倍后，做感官评价。

1.4.1.4 不同口味发酵果汁胶原蛋白饮料的感官评价

按照1.3饮料配方分别调配成发酵果汁胶原蛋白饮料，并做感官评价。

1.4.2 饮料的制备

按照常规的果汁饮料工艺流程制备发酵果汁胶原蛋白饮料。

1.4.3 饮料的产品质量分析

由福建省产品质量检验研究院进行产品质量分析，检测项目包括：可溶性固形物（20 ℃ 折光计法）；总酸（以柠檬酸计）；菌落总数；大肠杆菌；沙门氏菌；金黄色葡萄球菌；霉菌；酵母菌。

1.4.4 饮料的抗氧化能力测试

1.4.4.1 盐酸羟胺法

采用黄嘌呤氧化酶（羟胺法）测定样品对·O2-的清除能力，步骤按照论文[15]所述的SOD酶活测定方法。

式中，A2—空白组吸光值；A1—样品组吸光值。

1.4.4.2 铁离子还原法

抗氧化物质能使反应体系的Fe3+还原成Fe2+，可与菲啉类物质形成稳固的有色络合物，可根据比色法测定。步骤参照总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒。

1.4.4.3 DPPH自由基清除法采用DPPH法测定样品对DPPH·的清除能力[16]。

式中，A2—空白组吸光值；A1—样品组吸光值。

1.4.5 饮料的体外消化率测试

根据蛋白质/多肽都具有双缩脲反应，本文以双缩脲法测定样品的胶原蛋白肽含量，以反应饮料在体内被胃/肠道消化利用的程度。

模拟胃液/肠液配方——参照美国药典[18]。

模拟胃液：NaCl 2.0 g，胃蛋白酶3.2 g，HCl 7.0 mL，用ddH2O定容至1000 mL。

模拟肠液：

A液：KH2PO4 6.8 g，ddH2O 500 mL，用0.1 mol/L NaOH溶液调节pH值至6.8；

B液：胰蛋白酶10 g，加入适量ddH2O使溶解；

A、B液边搅拌边混匀，用ddH2O定容至1000 mL。

样品制备：取样品（60 mg/mL，50 mL）加入500 mL模拟胃液/肠液，37 ℃水浴，分别于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h取出2 mL×3组作为待测溶液。

步骤：参照总蛋白定量测试盒（双缩脲法），蛋白质含量用C表示。

式中，C0—未消化时的蛋白质浓度；C1—不同消化时间的蛋白质浓度。

1.4.6 饮料的抗疲劳能力测试

⑴ 负重游泳实验[19]：

对小鼠（约28 g）进行样品灌胃，0.5 h后，4个水桶分别放入6只尾部负荷5%体质量铅皮的小鼠，使其于水温为28 ℃、直径为35 cm、高32 cm的水桶中游泳。小鼠沉入水中连续3次，每次如果超过10 s无法重新浮出水面称为力竭。游泳开始至力竭的时间，为负重游泳时间。

⑵ 文献表明[20]，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）对机体具有抗疲劳能力，故作为阳性对照。

⑶ 给药量：对照组灌胃生理盐水0.24 mL，SOD组灌胃SOD（400 U/mL）0.24 mL，木瓜饮料组和复合莓饮料组灌胃每只0.24 mL，见表4。

式中，T0—空白组的负重游泳时间；T1—不同样品组的负重游泳时间。

1.5 数据处理

采用origin 9.0、excel 2013软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 饮料的口味确定

2.1.1 不同品牌胶原蛋白饮料的感官评价

图1 不同品牌胶原蛋白饮料感官评价结果

感官评定总分中（图1），保和堂和芳珂属于B级，依莲、益盛汉参、Lumi属于C级，天然派属于D级，没有一个品牌达到A级；口感+气味中，保和堂、益盛汉参属于C级，天然派、依莲属于D级，芳珂属于B级，没有一个品牌达到A级。所以，不同品牌胶原蛋白饮料的感官评价皆未能达到最佳等级。

2.1.2 不同口味发酵果汁的感官评价

为研制较佳口味胶原蛋白饮料，需要寻找较佳口味的发酵果汁作基础。

图2 不同口味发酵果汁感官评价结果

感官评定总分中（图2），发酵红枣浓缩汁、发酵苹果汁、发酵柠檬汁属于C级，发酵复合莓汁、发酵木瓜汁都属于B级；口感+气味中，发酵红枣浓缩汁、发酵木瓜汁属于B级，发酵复合莓汁属于A级，发酵苹果汁、发酵柠檬汁都属于C级。在感官评价总分/口感气味中，不同口味的发酵果汁的评分等级主要分布为B、C级水平，但还未达到最佳A级，而发酵苹果汁的评分最差。

综上，选择发酵红枣浓缩汁、发酵复合莓汁、发酵木瓜汁、发酵柠檬汁为发酵果汁胶原蛋白饮料的后续实验的果汁基础。

2.1.3 不同口味发酵果汁胶原蛋白饮料的感官评价

按照1.3饮料配方调配成发酵果汁胶原蛋白饮料，以胶原蛋白液、芳珂胶原蛋白饮料做对比，通过感官评价选择最受欢迎的2种果汁饮料。

图3 不同口味发酵果汁胶原蛋白饮料感官评价结果

由图3可得，随着胶原蛋白含量的增加，胶原蛋白饮料的感官评价分数呈降低的趋势。这是因为加入越多的胶原蛋白肽，果汁的香味越难以掩盖鱼皮胶原蛋白特有的腥臭味，进而影响饮料的风味；从感官评价总分/口感气味分数看，发酵木瓜型和发酵复合莓型2种口味的饮料略受欢迎，即便与芳珂胶原蛋白饮料对比，亦相差不大。

因此，选择发酵木瓜和发酵复合莓胶原蛋白果汁饮料作后续配方优化。

2.2 饮料的制备

为达到最佳的口感、色泽以及满足人体每日对胶原蛋白的需求，经糖酸比（酸∶柠檬酸+苹果酸）、胶原蛋白肽含量优化，饮料配方最终确定如表5。

2种饮料的最佳配方为：

⑴ 发酵木瓜果汁胶原蛋白饮料根据表1调配，且糖酸比38∶1（糖∶柠檬酸∶苹果酸=25∶0.35∶0.3=90∶1.26∶1.08），胶原蛋白肽含量6%；

⑵ 发酵复合莓果汁胶原蛋白饮料根据表1调配，糖酸比18∶1（糖∶柠檬酸∶苹果酸=25∶0.8∶0.6=90∶2.88∶2.16），胶原蛋白肽含量6%。

表5 发酵果汁胶原蛋白饮料配方表 单位：g

2.3 饮料的产品质量分析

发酵木瓜/复合莓果汁胶原蛋白饮料的pH值分别为4.32和4.14，均小于4.5，属于酸性饮料。经巴氏灭菌法（90 ℃，15 min）灭菌后的产品质量分析如表6。参照食品安全国家标准GB4789.2-2016，检验结果显示各项指标均为合格。

表6 发酵果汁胶原蛋白饮料的产品质量分析

2.4 饮料的抗氧化能力

图4 发酵果汁胶原蛋白饮料的抗氧化能力

通过3种方法检测发酵果汁胶原蛋白饮料的抗氧化能力，一定程度的表明其生物活性，结果如图4所示。

由图4可得：

⑴ 2种发酵果汁胶原蛋白饮料和胶原蛋白肽都具有一定程度的抗氧化能力。

⑵ 三种样品的抗氧化能力（用K表示）顺序：K发酵复合莓果汁胶原蛋白饮料＞K发酵木瓜果汁胶原蛋白饮料＞K胶原蛋白肽。

⑶ 胶原蛋白肽的基础上，添加发酵木瓜/复合莓果汁，有助于抗氧化能力的增加。

2.5 饮料的体外消化率

生物蛋白质属于大分子物质，在进入人体胃/肠道内，一般被降解消化成小分子物质，才易被吸收，且分子越小，越容易被吸收。所以，通过检测发酵果汁胶原蛋白饮料的体外消化率，一定程度反应饮料在胃/肠道内的吸收情况。体外消化率如图5所示。

图5 发酵果汁胶原蛋白饮料的体外消化率

发酵木瓜果汁胶原蛋白饮料、发酵复合莓果汁胶原蛋白饮料、胶原蛋白肽、BSA在模拟胃/肠液体系中的消化结果，有着大致相同的结论。

⑴ 随着消化时间延长，胃/肠道体系对样品的体外消化率总体上呈现上升趋势，即蛋白质/多肽被降解成更小分子。

⑵ 在胃/肠液体系，发酵木瓜果汁胶原蛋白饮料和发酵复合莓果汁胶原蛋白饮料的消化率（用D表示）比胶原蛋白肽的消化率稍高，即D发酵木瓜果汁胶原蛋白饮料≈D发酵复合莓果汁胶原蛋白饮料≥D胶原蛋白肽，表明发酵木瓜/复合莓果汁的添加，有助于胶原蛋白肽的降解消化，更加有利于人体吸收。

⑶ 各样品在肠液中的消化率比在胃液中的消化率显著较高，说明样品的消化吸收可能主要发生在肠道环境。

2.6 饮料的抗疲劳能力

图6 发酵果汁胶原蛋白饮料的抗疲劳能力

灌胃SOD、发酵木瓜果汁胶原蛋白饮料、发酵复合莓果汁胶原蛋白饮料的小鼠抗疲劳能力都有显著提高（p＜0.05），抗疲劳能力排序为：F发酵复合莓果汁胶原蛋白饮料＞FSOD＞F发酵木瓜果汁胶原蛋白饮料＞50%。

3 结论

⑴ 以发酵木瓜/复合莓口味作为饮料的果汁基础口感最好，其中：最适糖酸比分别为38∶1和18∶1；胶原蛋白肽含量皆为6%。

⑵ 饮料的抗氧化实验：2种果汁饮料皆具有抗氧化活性，其顺序为：K发酵复合莓果汁胶原蛋白饮料＞K发酵木瓜果汁胶原蛋白饮料＞K胶原蛋白肽，说明在胶原蛋白肽的基础上，添加发酵木瓜/复合莓果汁有助于抗氧化能力的增加。

⑶ 饮料的体外消化率实验：饮料的体外消化率D发酵木瓜果汁胶原蛋白饮料≈D发酵复合莓果汁胶原蛋白饮料≥D胶原蛋白肽，表明发酵木瓜/复合莓果汁的添加，有助于胶原蛋白肽的降解消化，更加有利于人体吸收。

⑷ 饮料的抗疲劳实验：灌胃2种饮料皆能显著提高小鼠的抗疲劳能力（p＜0.05），抗疲劳能力排序为：F发酵复合莓果汁胶原蛋白饮料＞F发酵木瓜果汁胶原蛋白饮料＞50%。

所以，在体外消化率相当的基础上，小鼠的抗疲劳能力与饮料的抗氧化能力呈正相关。

综上，本文研制的发酵果汁胶原蛋白饮料具有口感好、生物活性功能多样的特点，可望为市场所接受。