人参须浸膏真空带式干燥工艺优化及其总酚对酪氨酸酶的抑制活性

郭小莉，李红娟，高如意，杨晓筱，柏伟荣，肖 伟

（江苏康缘药业股份有限公司，中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港222001）

人参须为五加科植物人参Panax ginsengC.A.Meyer的细枝根及须根，传统认为人参主根效力强，而参须效果差，故前者价格较后者贵得多［1］。目前，关于人参须提取物制备工艺功效成分的检测以人参皂苷［2］、人参多糖［3］为主。

人参须浸膏是为人参须经水提取、浓缩、精制而成，含多糖、皂苷、黄酮等多种成分［4］，黏性大，不容易干燥，采用喷雾干燥时易粘壁，有效成分受热容易损失［5-6］；板式真空干燥时时间比较长，有效成分受热不稳定，会有损失；冷冻干燥时干燥品性状较好，但成本较高；真空带式干燥是一种具有连续进料和出料形式的接触式真空干燥设备，在整个干燥过程中处于真空、封闭环境下［7］，具有干燥时间短、有效成分转移率高、可连续化生产等特点［8］，既保证了产品质量，又提高了经济效益，但目前尚无将其应用于人参须酚类成分的报道。因此，本实验通过Box-Behnken响应面法优化人参须浸膏真空带式干燥工艺，并检测其总酚对酪氨酸酶的抑制活性［9］。

1 材料

UV-2700紫外分光光度仪（日本岛津公司）；Sartorius BSA224S-CW 电子分析天平（德国赛多利斯公司）；FA2004分析天平（上海舜宇衡平科学仪器有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）；LYO-1 m2冷冻干燥机（上海东富龙科技股份有限公司）；板式真空干燥箱（杭州三特医药化工设备有限公司）；MTVBD-1-4-1真空带式干燥机（上海郎脉新化工技术有限公司）；B-290喷雾干燥机（瑞士Buchi 公司）；Flex 3多功能酶标仪（江苏省科学器材有限公司）；R2002B 旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）。

人参须浸膏（江苏康缘药业股份有限公司，批号20170911，总酚含有量1.67%）。没食子酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110831-201605，含有量90.8%）；蘑菇酪氨酸酶（货号T3824-25Ku，2 687 U／mg）、酪氨酸（色谱纯，含有量98%）（美国Sigma 公司）。所用试剂均为分析纯；水为超纯水（自制）。

2 方法与结果

2.1 浸膏制备 药材去除杂质，洗净，加入10倍量水回流提取2次，每次2 h，药液过滤，滤液减压浓缩至相对密度1.10～1.15，加乙醇至含醇量为75%，静置过夜，收集上清液，减压浓缩至相对密度1.20，即得。

2.2 总酚含有量测定［9］

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取没食子酸对照品50 mg，置于100 mL 棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密吸取5 mL，置于50 mL 棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得（每1 mL 含没食子酸50 μg）。

2.2.2 供试品溶液制备 精密称取干膏粉25 mg，置于25 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 标准曲线绘制 精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于具塞试管中，加水补至1.0 mL，加入4 mL 2% 碳酸钠，摇匀，室温下放置2 min，加入0.2 mL 50%福林酚试剂，摇匀，室温下放置30 min，以相应试剂为空白，紫外-可见分光光度法在750 nm 波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，溶液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.2.4 转移率测定 精密量取供试品溶液1 mL，按“2.2.3”项下方法绘制标准曲线，测定总酚含有量，计算转移率，公式为转移率=［干膏中总酚含有量×干膏质量／（浸膏中总酚含有量×浸膏质量）］×100%。

2.3 干膏含水量测定 精密称取干膏2 g，按照2015年版《中国药典》 四部通则0832水分测定法第二法（烘干法）测定。

2.4 干燥方式比较［8］

2.4.1 板式减压干燥 称取浸膏3 kg，置于板式减压干燥箱中，温度65 ℃，真空度-0.08～-0.1 MPa，记录干燥时间、干膏含水量、总酚转移率。

2.4.2 真空冷冻干燥 称取浸膏3 kg，加水稀释至相对密度1.1，将其平铺于铁盘中，高度不超过10 mm，预冻温度-45 ℃，设定时间1 min，保持4 h；升华干燥温度20 ℃，设定时间30 min，保持4 h；解析干燥温度25 ℃，设定时间15 min，保持4 h，记录干燥时间、干膏含水量、总酚转移率。

2.4.3 喷雾干燥 称取浸膏3 kg，加水稀释至相对密度1.1，设定喷雾干燥机进风温度175 ℃（波动范围±5 ℃），出风温度90～95 ℃，收集喷干粉，记录干燥时间、干膏含水量、总酚转移率。

2.4.4 真空带式干燥 称取浸膏3 kg，加热区温度90 ℃，进料速度1.5 kg／h，干燥时间2 h，收集干膏，按“2.2.4”和“2.3”项下方法分别测定总酚转移率和干膏含水量。

2.4.5 结果分析 表1显示，板式真空干燥时间最长，干膏含水量最高；冷冻干燥所得干膏性状理想，总酚损失最小，含水量低，但耗时相对较长；喷雾干燥时间短，但总酚转移率低；真空带式干燥总酚转移率较高，仅次于冷冻干燥，而且干燥时间短，含水量低，干膏性状理想，故选择该方法进行干燥。

表1 不同干燥方式比较

2.5 工艺优化

2.5.1 单因素试验 根据预实验结果结合实际生产经验，设计单因素试验对加热区温度、干燥时间、进料速度进行考察［10-12］，以总酚转移率、干膏含水量的综合评分为评价指标，含水量得分=（1-含水量）×100，总酚转移率得分=总酚转移率／最大值×100，综合评分=总酚转移率得分×0.6＋干膏含水量得分×0.4。

2.5.1.1 加热区温度 取“2.1”项下浸膏，设定干燥时间100 min，进料速度1.5 kg／h，考察加热区温度60、70、80、90、100、110 ℃，结果见图1。由图可知，随着加热区温度增加，总酚转移率随之升高，干膏含水量随之降低；大于90 ℃时，对干膏含水量的影响程度降低，而且此时总酚受热不稳定，含有量会降低，故确定加热区温度为80～100 ℃。

图1 加热区温度对总酚转移率、干膏含水量的影响

2.5.1.2 干燥时间 取“2.1”项下浸膏，设定加热区温度90 ℃，进料速度1.5 kg／h，考察干燥时间70、80、90、100、110、120 min，结果见图2。由图可知，随着干燥时间延长，总酚转移率随之升高，干膏含水量随之降低；大于100 min 时，须总酚转移率开始下降，但干膏含水量变化趋势不大，故确定干燥时间为90～110 min。

图2 干燥时间对总酚转移率、干膏含水量的影响

2.5.1.3 进料速度 取“2.1”项下浸膏，设定加热区温度90 ℃，干燥时间100 min，考察进料速度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 kg／h，结果见图3。由图可知，随着进料速度加快，总酚转移率随之升高，同时由于浸膏在履带上涂布量少，故干膏含水量较低；当大于1.5 kg／h 时，涂布在履带上的浸膏厚度越大，水分蒸发越慢，干膏含水量越高，故确定进料速度为1.0～2.0 kg／h。

图3 进料速度对总酚转移率、干膏含水量的影响

2.5.2 Box-Behnken 响应面法［13］在单因素试验基础上，以加热区温度（A）、干燥时间（B）、进料速度（C）为影响因素，每个因素3个水平，因素水平见表2，结果见表3。

表2 因素水平

表3 试验设计与结果

通过Design-Expert 8.0.6软件对表3数据进行二次多元拟合，得到综合评分（Y）回归方程为Y=98.18-0.016A-0.41B-0.18C＋0.37AB-0.021AC-0.74BC-2.02A2-1.32B2-1.17C2（R2=0.985 2），方差分析见表4。由表可知，模型F=51.82，P＜0.000 1，表明模型显著；失拟项不显著（P＞0.05），表明试验误差较小，模型拟合度良好；因素B、BC、AB、A2、B2、C2有显著影响（P＜0.05）。

表4 方差分析

响应面分析见图4，可知最优工艺为加热区温度89.43 ℃，干燥时间98.51 min，进料速度1.48 kg／h，考虑到实际生产操作，将其修正为加热区温度89 ℃，干燥时间99 min，进料速度1.5 kg／h，综合评分98.22。然后，根据优化工艺取浸膏3份，每份6 kg，进行3批验证试验，结果见表5，可知工艺稳定可行。

表5 验证试验结果（n=3）

2.6 总酚对酪氨酸酶的抑制活性 蘑菇酪氨酸酶具有单酚酶、二酚酶活性［14］，两者分别以L-酪氨酸、L-多巴为底物，本实验主要研究前者［15］。

精密称取验证试验项下干膏粉75 mg（总酚含有量为9.8%），置于1 mL 量瓶中，0.05 mol／L 磷酸盐缓冲液（pH=6.8）溶解并定容，2倍稀释法稀释成不同质量浓度，作为样品溶液。取100 μL 置于96孔培养板中，加入80 μLL-酪氨酸溶液（2 mmol／L），与20 μL 酪氨酸酶溶液（600 μmol／L）充分混匀（组成见表6），37 ℃下孵育25 min，在490 nm 波长处检测光密度（OD）值。以抑制率为纵坐标，总酚质量浓度为横坐标绘制曲线，计算IC50，测定酪氨酸酶抑制率，公式为抑制率=［1-（B-B1）／（A-A1）］×100%（A、A1、B、B1分别为对照组、空白对照组、实验组、空白实验组在490 nm 波长处的OD 值），结果见图5。由图可知，总酚对酪氨酸酶有抑制作用，并呈一定浓度依赖性，IC50为2.94 mg／mL。

图4 各因素响应面图

表6 反应液组成

3 讨论

与传统干燥方式比较，真空带式干燥是在真空条件下使物料经过布料机，将浸膏较薄的部分涂布在传送带上，从而能连续进料和出料，所得干膏性状及溶解性较好，而且不容易吸潮，尤其是对于含糖量高、易吸潮的中药浸膏，能在较短时间内得到干燥品，并且在最大程度上保留物料有效成分。本实验通过Box-Behnken 响应面法优化人参须浸膏真空带式干燥工艺，并进行中试规模的验证试验，发现人参须总酚转移率达94.22%，即能大规模保留中药浸膏中有效成分，该方法优化得到的工艺参数具有实用价值。

图5 酶抑制活性曲线

然后，考察人参须总酚对酪氨酸酶的抑制活性，发现它具有抑制作用，并呈一定浓度依赖性，IC50为2.94 mg／mL。目前，关于人参功效成分对酪氨酸酶的抑制作用研究大多集中在人参皂苷方面，而鲜有人参酚类成分，故本实验结果可为人参须的加工和开发提供参考依据。