防治红枣黑斑病的杀菌剂筛选和复配研究

刘础荣 董玥 吕青阳

摘要 采用菌丝生长速率法和孢子萌发抑制法，测定了14种杀菌剂单剂及基于单剂筛选结果的二元复配剂对红枣黑斑病菌Alternaria tenuissima菌丝生长和孢子萌发的抑制作用，以此评价防治红枣黑斑病的杀菌剂和复配药剂的效果。结果表明，咯菌腈和嘧菌环胺对靶标病菌菌丝生长的抑制效果最佳，其EC50分别为0.091 3和0.099 8 μg/mL;吡唑醚菌酯和啶酰菌胺对病菌孢子萌发抑制效果最佳，其EC50分别为0.015 3和0.293 4 μg/mL。吡唑醚菌酯与戊唑醇按照8∶2和3∶7（w/w）的比例进行复配，对病菌菌丝生长的抑制表现出相加作用，其SR值分别为1.124 5和0.916 9;两者以5∶5和3∶7（w/w）的比例进行复配，对孢子萌发的抑制表现出相加作用，其SR值分别为1.164 6和0.901 0。吡唑醚菌酯、啶酰菌胺、咯菌腈、嘧菌环胺和异菌脲等对病菌菌丝生长和孢子萌发均有抑制效果;吡唑醚菌酯与戊唑醇3∶7（w/w）复配对病菌菌丝生长及孢子萌发的抑制效果均表现出相加作用。上述结果为红枣黑斑病防治药剂的开发和后续田间应用提供了理论支持。

关键词 红枣黑斑病; 链格孢菌; 毒力测定; 药剂复配

中图分类号： S 432.1  文献标识码： B  DOI： 10.16688/j.zwbh.2018438

Abstract In order to evaluate the effect of fungicides for controlling black spot of jujube （Ziziphus jujuba）， 14 fungicides as well as their cocktail mixture were screened by measuring the mycelial growth and spore germination. The results indicated that mycelial growth of Alternaria tenuissima was strongly inhibited by fludioxonil and cyprodinil， with the EC50 values of 0.091 3 and 0.099 8 μg/mL， respectively. The spore germination was strongly inhibited by pyraclostrobin and boscalid， with the EC50 values of 0.015 3 and 0.293 4 μg/mL， respectively. The mixture of pyraclostrobin and tebuconazole had an additive effect on the inhibition of mycelial growth at the ratio of 8∶2 or 3∶7（w/w）， with the synergistic ration （SR） value of 1.124 5 and 0.916 9， respectively. The mixture of these two fungicides also had an additive effect on the inhibition of spore germination at the ratio of 5∶5 or 3∶7（w/w）， with the SR value of 1.164 6 and 0.901 0， respectively. In conclusion， pyraclostrobin， boscalid， fludioxonil， cyprodinil and iprodione showed inhibition effects on mycelial growth and spore germination. The mixture of pyraclostrobin and tebuconazole at the ration of 3∶7 had additive effect both on mycelial growth and spore germination， indicating that these fungicides and mixture supplied an alternative choice for jujube black spot disease control in field.

Key words jujube black spot; Alternaria sp.; toxicity test; fungicide mixture

棗树 Ziziphus jujuba为鼠李科枣属植物。红枣是我国特有的优质水果。我国拥有全世界98%的红枣种质资源，并为世界贡献了99%的红枣产量[1-2]。近年来，新疆已经成为我国最重要的优质商品红枣生产基地，在喀什、阿克苏及和田形成了三大红枣主产区。据2016年国家统计局数据[3]，新疆红枣年产量326.42万t，居全国第一。伴随红枣产业的快速发展，枣园病害发生严重，其中红枣黑斑病自2009年在和田等地首次发现，2010年在阿克苏地区大面积发生[4]，2013年南疆多个地区再次大面积发生，果实发病率高达20%～30%，严重危害红枣产量和品质，造成巨大的经济损失[5]。

引起新疆维吾尔自治区红枣黑斑病的主要病原菌为细极链格孢Alternaria tenuissima[6]。该病原菌可引起多种植物病害，曾导致美国伊利诺伊州大豆发生猝倒病而减产15%[7];该菌在印度引起茄子叶斑和茄果腐烂病[8]，在伊朗引起草莓叶斑病[9]。在国内也有细极链格孢引起五味子黑斑病[10]和枣缩果病[11-12]的报道。该病原菌除引起病害还能够产生交链格孢霉烯和链格孢酚等真菌毒素，严重威胁食品安全[13]。

目前，新疆地区主要通过施用化学药剂防控红枣黑斑病，但缺少针对红枣黑斑病的高效药剂[14]以及更加科学的施药方案。因此，本文针对防治红枣黑斑病的杀菌剂进行了单剂筛选和Wadley法复配研究，旨在为红枣黑斑病防治药剂的开发和田间应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试药剂

供试的14种杀菌剂均由中国农业大学植物病理学系种子病理与杀菌剂药理学研究室提供（表1）。

1.1.2 靶标病菌

引起红枣黑斑病的细极链格孢A.tenuissima菌株由塔里木大学植物科学学院提供。

1.1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖18 g，琼脂粉14 g，去离子水1 L。

水琼脂：琼脂粉10 g，去离子水1 L。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株活化

将供试菌株接种在PDA平板上，28℃黑暗培养5 d后备用。

1.2.2 杀菌剂对A.tenuissima菌丝生长的影响

采用中华人民共和国农业行业标准 （NY/T1156.2-2006）中的平皿菌丝生长抑制法进行试验[16]。供试杀菌剂均以二甲基亚砜为溶剂配制为1 000 μg/mL的母液，再依次稀释为100、10、1、0.5、0.1、0.01和0.001 μg/mL 7个浓度，制成含药PDA平板。以添加等体积的溶剂和蒸馏水作为溶剂和空白对照。用直径5 mm的打孔器在靠近菌落边缘的同一圆周上打取菌饼并接种到不同浓度的含药PDA平板中央，每浓度3次重复。28℃黑暗培养5 d，采用十字交叉法测定菌落直径，计算相对抑制率。

相对抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%;

以设定浓度的对数为横坐标（x），抑制率几率值为纵坐标（y），求出各药剂对供试病菌的毒力回归曲线方程y=ax+b、决定系数R2以及有效抑制中浓度（EC50）。最后根据EC50，分析比较不同杀菌剂对供试病菌菌丝生长的影响。

1.2.3 杀菌剂对A.tenuissima孢子萌发的影响

将5 mm的A.tenuissima菌饼菌丝面朝下接种到PDA平板中央，28℃黑暗培養8 d，待菌丝铺满整个平板后加入10 mL无菌水洗脱孢子，用4层纱布过滤获得孢子悬浮液。加入无菌水制备成浓度为1×106个/mL的分生孢子悬浮液[17]。吸取150 μL分生孢子悬浮液均匀涂布在含不同浓度药剂的水琼脂平板上，25℃黑暗培养6 h后镜检（放大倍数10×10），每浓度3次重复，每次重复调查100个分生孢子。孢子萌发的标准为芽管长超过孢子长度的一半[18]。计算杀菌剂对红枣黑斑病菌分生孢子萌发的抑制率。

孢子萌发率=（萌发孢子数/孢子总数）×100%;

相对抑制率=（对照组孢子萌发率-处理组孢子萌发率）/对照组孢子萌发率×100%。

1.2.4 杀菌剂复配设计

根据供试杀菌剂单剂对菌丝生长和孢子萌发的EC50测定结果，最终选取吡唑醚菌酯和戊唑醇进行复配，评价药剂混用后的联合作用。将吡唑醚菌酯和戊唑醇按2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2等进行复配，测定复配剂对供试菌株菌丝生长和孢子萌发的EC50，同时按Wadley法计算增效系数（SR）。SR<0.5为拮抗作用，0.5≤SR≤1.5为相加作用，SR>1.5为增效作用[19]。

SR=EC50（理论）/EC50（实际）;

EC50（理论）=a+baEC（A）50+bEC（B）50。

a、b分别为相应单剂在复配剂中所占比例，A、B分别为吡唑醚菌酯和戊唑醇。

2 结果与分析

2.1 供试杀菌剂单剂对A.tenuissima菌丝生长的影响

药剂对A.tenuissima菌丝生长的影响如表2所示。咯菌腈和嘧菌环胺对菌丝生长的抑制效果最佳，其EC50分别为0.091 3和0.099 8 μg/mL;其次为异菌脲、咪鲜胺、己唑醇、吡唑醚菌酯、咪鲜胺锰盐、氟硅唑和苯醚甲环唑，其EC50范围在0.268 8～0.515 6 μg/mL;丙环唑、啶酰菌胺、腐霉利、嘧菌酯和戊唑醇的EC50范围在1.188 8～3.256 1 μg/mL。

2.2 供试杀菌剂单剂对A.tenuissima孢子萌发的影响  供试药剂对A.tenuissima孢子萌发的影响如表3所示。其中，吡唑醚菌酯对孢子萌发的抑制效果最佳，EC50为0.015 3 μg/mL;其次为啶酰菌胺，EC50为0.293 4 μg/mL;嘧菌酯、异菌脲、咯菌腈和腐霉利的EC50范围在1.692 4～4.016 4 μg/mL;嘧菌环胺的EC50为19.134 μg/mL。7种细胞膜甾醇合成抑制剂在供试浓度下对A.tenuissima孢子萌发均没有抑制效果。

2.3 供试杀菌剂复配药剂对A.tenuissima菌丝生长的影响  吡唑醚菌酯和戊唑醇的不同配比组合对A.tenuissima菌丝生长的影响如表4所示。除吡唑醚菌酯∶戊唑醇=5∶5（w/w，下同）表现出拮抗作用外，其余6种配比均表现出相加作用。其中吡唑醚菌酯∶戊唑醇=8∶2时增效最明显，其SR值为1.124 5;其次为3∶7和2∶8的配比组合，其SR值分别为0.916 9和0.818 4;吡唑醚菌酯和戊唑醇的配比为6∶4、7∶3和4∶6时相加作用不显著。

2.4 供试杀菌剂复配药剂对A.tenuissima孢子萌发的影响  吡唑醚菌酯和戊唑醇的不同配比组合对A.tenuissima孢子萌发的影响如表5所示，其中吡唑醚菌酯：戊唑醇=5∶5时相加作用最为明显（SR值=1.164 6），3∶7、2∶8、6∶4和4∶6 4个配比也表现为相加作用，其SR值分别为0.901 0、0.798 3、0.720 2和0.520 6，而8∶2和7∶3表现为拮抗作用。

3 结论与讨论

本研究选用14种杀菌剂单剂对A.tenuissima进行了菌丝生长和孢子萌发抑制试验，结果表明咯菌腈、嘧菌环胺、异菌脲、咪鲜胺、己唑醇、吡唑醚菌酯、咪鲜胺锰盐、氟硅唑和苯醚甲环唑等9种药剂对A.tenuissima菌丝生长有抑制活性;吡唑醚菌酯和啶酰菌胺对病原菌孢子萌发有抑制效果;以三唑类为代表的麦角甾醇生物抑制剂对病原菌孢子萌发均没有明显的抑制效果，这与麦角甾醇生物合成抑制剂的作用机理相关，有研究认为麦角甾醇生物抑制剂对菌丝生长有显著影响，但不影响孢子萌发[20]。这与本研究结果一致。

吡唑醚菌酯的作用机理是阻止呼吸作用复合物Ⅲ中细胞色素b和c1之间的电子传递，使线粒体无法为细胞提供能量而导致其死亡，达到杀死病原菌的目的。吡唑醚菌酯能抑制病原菌菌丝生长也能抑制孢子萌发，具有治疗、保护、铲除、强内吸性及耐雨水冲刷等特性[21-22]，已被用于许多真菌病害的防治，且在大豆[23]、玉米[24]及棉花[25]等作物上的保健、增产和促生作用被不断证明;戊唑醇是1986年德国拜耳公司开发的一种高效、广谱、低毒的三唑类杀菌剂，其作用机理是抑制真菌细胞壁中麦角甾醇中间体的氧化脱甲基反应从而抑制病原菌生长[26]，具有保护、治疗、铲除及持效期长等特性。

吡唑醚菌酯和戊唑醇均为高效、广谱、低毒的杀菌剂，且作用类型不同。本文选择这两种药剂进行复配，研究其单剂和复配剂对病原菌菌丝生长和孢子萌发的影响，采用Wadley法计算复配药剂的增效系数，最终获得了对A.tenuissima菌丝生长和孢子萌发抑制均表现出相加作用最优复配组合。

红枣黑斑病是近年来流行在新疆红枣产区的主要病害之一，对红枣的生产和品质造成了严重的影响，多种杀菌剂交替使用或运用复配药剂可以缓解由于长期施用单一杀菌剂产生的抗药性问题，延长杀菌剂的使用寿命。另一方面，戊唑醇的价格远低于吡唑醚菌酯，二者复配还能降低田间用药成本。本研究为红枣黑斑病的科学用药提供了理论支持。但在自然条件下，由于气候、施药时期和方式、药剂与病原菌的接触程度等因素，室内毒力测定试验的结果往往与田间试验获得的结果有一定偏差。因此，本研究筛选出的单剂和混剂配比还需田间试验进一步验证。

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（责任编辑： 杨明丽）