牛病毒性腹泻病毒Core蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

张 康，张 璇，闫遵祥，王 磊，张 凯，张景艳，罗永江，仇正英，薛 欢，李建喜，*

(1.中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所/农业农村部兽用药物创新重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃 兰州730050；2.兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050；3.西安交通大学 基础医学院，陕西 西安 710061)

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhoea viruses，BVDV)是黄病毒科瘟病毒属的成员，其结构是单股正链RNA基因组，大小约为12.3 kb[1-2]。BVDV通过网格蛋白介导的内吞作用进入宿主细胞，在病毒和宿主的蛋白酶共同水解和切割作用下，会形成12种成熟蛋白，包括P14(Core)、gp48(Erns)、gp25(E1)和gp53(E2) 4种结构蛋白和Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[3]8种非结构蛋白。目前该病毒在世界范围内广泛分布，许多养牛业发达国家也有广泛流行，严重影响养牛业的发展[4-7]。Core蛋白是由糖胺聚糖共价结合组成的多肽链，在病毒侵染宿主细胞的过程中起重要作用[8]。成熟的Core蛋白以病毒粒子结合形式存在，由90个氨基酸组成，并通过3种酶的作用将其从多聚蛋白链中切割下来。其中，Npro通过共翻译自身蛋白水解加工形成Core蛋白氨基末端。随后Core蛋白羧基末端的信号序列将其靶向运输至内质网膜。宿主酶在内质网腔中启动双重加工，信号肽酶从Erns上将蛋白切割下来，释放出的Core蛋白属于高度碱性并被推测其与RNA具有结合性[9]。目前研究表明，Core蛋白的抗原表位不仅可以被B细胞识别，也可以被CD4T细胞识别[10]；BVDV Core基因重组腺病毒免疫小鼠后，产生的抗体与BVDV-1和BVDV-2均能产生特异性免疫反应，证明Core蛋白具有很好的免疫原性[11]。因此，为进一步开展Core蛋白的检测和生物学功能研究工作，本实验利用原核表达系统得到了Core蛋白，纯化后制备了兔抗Core蛋白多克隆抗体。

1 材料与方法

1.1 载体及菌株

Pet30a质粒载体、BVDV NABL标准毒株、TOP10克隆菌株均来源于兰州畜牧与兽药研究所中兽医实验室。

1.2 主要试剂及酶

限制性内切酶购自TaKaRa公司；DNA聚合酶购自Zoonbio公司；Tyrptone、Yeast Extract购自OXOID公司；Agarose购自上海基因公司；DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒购自AXYGEN公司；弗氏佐剂、Acr、Bis和Tris购自Sigma公司；羊抗兔-HRP购自上海生工生物科技有限公司；SDS购自Amresco公司；TEMED购自BIO-RAD公司；其他试剂均为国产分析纯或化学纯。

1.3 主要试验仪器设备及耗材

Allegra 21R 台式高速冷冻离心机购自美国BECKMAN公司；台式高速离心机购自德国SORVAL公司；Biologic LP层析系统、Mini Protean Ⅱ垂直平板电泳系统、Gel Doc2000成像系统、水平电泳系统购自美国BIO-RAD公司；PTC-200基因扩增仪购自美国MJ Research公司；320-SpH计购自美国Mettler Toledo公司；AR5120电子天平购自美国AHOM S公司；MultiTemp Ⅲ恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪购自美国Amersham Pharmacia公司；酶标仪、洗板仪购自Thermo公司；NANODROP2000购自Thermo公司；0.22 μm无菌滤器和透析袋购自Millipore公司。

1.4 Core相应基因片段的扩增

按照RNA提取试剂盒说明书提取BVDV NADL标准毒株感染的牛肾细胞上清中的病毒RNA，用反转录酶进行反转录，然后PCR扩增BVDV Core基因。参考设计Core蛋白对应基因序列(GenBank登录号AJ133738.1)的上游引物: F：5′-CCGCATATGTCAGACACGAAAGAAGAGGGAGC-3′；下游引物R：5′-GCCCTCGAGTCCCATTGTAACTTGAA-3′，扩增产物大小约为324 bp，斜体部分为5′端添加的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，酶切位点前为保护性碱基。

1.5 Core重组表达载体的构建

用Pet30a载体连接回收产物后转至TOP 10感受态细胞，并置于37 ℃水浴锅中酶切，2 h后将酶切后的pet 30a载体片段进行核酸电泳，并利用DNA胶回收试剂盒对产物进行回收和纯化；利用XhoⅠ和NdeⅠ两种酶按照上述方法对Core片段进行酶切作用后，胶回收备用将纯化的Core酶切产物用T4连接酶于4 ℃连接，12 h后将所得产物转至感受态细胞，并将感受态细胞置于摇床中不含抗生素的LB培养基复苏培养45 min；用涂布棒将复苏后的100 μL菌液均匀涂抹在含有卡那霉素的LB平板上，置于温度为37 ℃条件下培养，12～16 h后选取单菌落并移至含有卡那霉素的LB液体培养基中，并将培养基置于摇床中，于37 ℃、220 r·min-1条件下培养4～6 h至菌液浑浊。将培养好的菌液送至宝生物工程(大连)有限公司进行测序，并将鉴定正确的阳性质粒命名为Pet30a-Core菌液于-80 ℃冻存。

1.6 Pet30a-Core的诱导表达

将重组载体转化至大肠埃希菌TOP10中，37 ℃ 220 r·min-1振摇至菌体D600为0.6～0.8；加入IPTG至终浓度为0.5 mmol·L-1，37 ℃ 220 r·min-1振摇4 h，诱导融合蛋白表达；取出培养物离心后，收集菌体，加入PBS进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。进行12% SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝染色显带。

1.7 重组蛋白Core的纯化和透析

将鉴定可以成功表达的含有Pet30a-Core重组质粒的菌液按1∶100的比例于500 mL LB培养基中扩大培养，至菌液D值达到0.6～0.8时，加入IPTG诱导剂，置于37 ℃恒温摇床中100 r·min-1振荡诱导24 h，离心收集菌体。

将表达后的菌体进行超声破碎后，加入细胞裂解液4 ℃ 10 000 r·mim-1离心20 min，收集沉淀。采用融合蛋白的Ni柱亲和法纯化透析复性，去除蛋白溶液中的咪唑等有害物质，纯化的蛋白进行12% SDS-PAGE分析，并用His单抗进行Western blot鉴定，蛋白分装保存于-80 ℃。

1.8 多克隆抗体的制备

以原核表达的BVDV Core蛋白进行BCA浓度测定后，免疫2只新西兰白兔(2.0～2.5 kg)，皮下免疫400 μg·次-1，2～3周免疫1次。采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对BVDV Core蛋白的效价，待效价大于1∶50 000进行最终采血制备抗血清。

1.9 兔抗Core蛋白多克隆抗体效价的测定

以纯化的重组Core蛋白为包被抗原(包被浓度为5 μg·mL-1)，以免疫前的兔血清作为阴性对照，将纯化后的抗体按1∶500～1∶512 000倍比稀释，以1∶5 000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG为酶标二抗，37 ℃恒温箱1 h，以TMB显色液，进行间接ELISA检测。即刻在酶标仪上450 nm读数，将D值大于设定的阴性对照D值的2.1倍的孔对应的稀释度，判定为兔抗Core蛋白多克隆抗体的效价。

1.10 蛋白质印迹法(Western blot)检测多克隆抗体的反应性

蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后，将其转印至PVDF膜，并在室温下于5%脱脂奶粉中封闭2 h。于4 ℃条件下孵育1∶4 000倍比稀释的抗Core多抗10 h，并利用TBST洗膜20 min·次-1，3次后加入1∶10 000稀释的 HRP标记的羊抗兔IgG，于室温条件下作用2 h，再次进行TBST洗膜操作后使用ECL发光试剂盒进行显色，并置于X光胶片暗室内曝光。

1.11 间接免疫荧光(IFA)检测多抗的反应性

将成功感染BVDV的牛肾细胞和健康牛肾细胞固定后，分别将1∶200稀释的抗Core多抗加入并孵育1 h，将FITC标记的1∶200稀释度的羊抗兔二抗加入并孵育1 h，封片并观察荧光。

2 结果与分析

2.1 Core基因的PCR扩增和质粒鉴定

以BVDV NADL标准毒株的RNA为模板，经反转录、PCR扩增、1%的核酸电泳后，可分别在324 bp左右出现一个特异性条带，其分子质量和预期结果一致。重组质粒Pet30a-Core双酶切后得到的基因大小为306 bp，说明重组质粒构建成功。

M，DNA marker 4500；1，PCR产物；2，Pet30a-Core的NdeⅠ和XhoⅠ酶切鉴定。M， DNA marker 4500; 1， PCR product; 2， Pet30a-Core digested by NdeⅠ and XhoⅠ.图1 Core蛋白基因的PCR扩增及双酶切鉴定Fig.1 The PCR product of Core gene and identification of plasmid Pet30a-Core by restriction enzyme digestion

2.2 重组蛋白Core的诱导表达及纯化

挑取转至TOP 10的Pet30a-Core阳性单菌落加入到含有50 μg·mL-1卡那霉素抗性的LB培养基中置于37 ℃、220 r·min-1恒温摇床中培养，培养至菌液D值在0.6～0.8时，按1∶2 000加入IPTG诱导24 h；将诱导后的菌液高压破碎后SDS-PAGE电泳检测表达情况，图2中的1-4结果显示Core重组蛋白有表达且不可溶，图2中的5至7为纯化结果。

2.3 Core蛋白多抗效价测定结果

M，蛋白质分子量标准；1，未诱导的Pet30a-Core全细胞；2，诱导IPTG的Pet30a-Core全细胞；3，诱导IPTG后的Pet30a-Core上清；4，诱导IPTG后的Pet30a-Core沉淀；5～7，蛋白洗脱组分。M， Protein marker; 1， Uninduced Pet30a-Core whole cells; 2， Pet30a-Core whole cells induced with IPTG; 3， Pet30a-Core supernatant after inducted with IPTG; 4， Pet30a-Core precipitation after inducted with IPTG; 5-7， Eluted proteins from column.图2 Core蛋白的表达和可溶性分析Fig.2 The expression of Core protein and solubility analysis

采集免疫后兔子血液，收集血清，采用间接ELISA的方法测定所获得的Core蛋白多抗效价，结果可以看出多抗血清效价高于1∶512 000(图3)。

2.4 Core兔源多抗的鉴定

于BVDV NADL株感染牛肾细胞后28 h，利用Western blot对收集到的细胞进行电泳，或将细胞固定进行间接免疫荧光检测，进而测定Core蛋白在细胞中的表达。将1∶1 000稀释的兔源Core多抗作为一抗，再将HRP标记羊抗兔IgG 1∶10 000稀释后作为二抗。Western blot电泳显示，Core蛋白在BVDV感染的细胞中为阳性，而在未感染BVDV的牛肾细胞中为阴性(图4)。间接免疫荧光结果显示：BVDV感染能利用多克隆抗体检测到(图5)。结果表明，本研究制备的Core兔源多抗可通过Western blot和IFA检测到BVDV Core蛋白。

图3 Core蛋白多克隆抗体效价Fig.3 Core titer of polyclonal antibodies

1～2，感染牛病毒性腹泻病毒NADL株后的细胞上清；3，健康牛肾细胞上清。1-2， Cell supernatant after infected with BVDV NADL strain; 3， Healthy MDBK cell supernatant MDBK.图4 Core蛋白多克隆抗体的Western blot鉴定Fig.4 Western blot identification of Core polyclonal antibodies

1，Core蛋白多克隆抗体试验组；2，阴性对照组。1， Anti-Core polyclonal antibody group; 2， Negative control group.图5 Core蛋白多克隆抗体的IFA鉴定Fig.5 IFA identification of Core polyclonal antibodies

3 讨论

Core蛋白是黄病毒科病毒的重要结构蛋白之一，其N-端由Npro水解产生，C-端由宿主细胞的信号肽酶切形成[12]。在与BVDV同科的猪瘟病毒(CSFV)、丙型肝炎病毒(HCV)等病毒的研究中发现，Core蛋白对病毒的感染和增殖具有关键作用，其能抑制宿主细胞信号的表达，从而抑制宿主细胞代谢、增强病毒本身的侵入和增殖能力[13]。例如，CSFV的复制增殖过程中，血红蛋白β亚基(HB)能够起到抑制作用，它可以和视黄酸(维甲酸)诱导基因蛋白Ⅰ相互作用激活 IFN-β的表达，但是HB的表达又受到CSFV Core蛋白的抑制[14]。许多研究表明HCV的Core 蛋白可以被多种宿主蛋白结合，Core蛋白可以与T淋巴细胞表面的球状C1q受体结合，抑制相关白介素基因的转录，从而抑制淋巴细胞的增殖[15]；和波型蛋白结合，能调节细胞的信号转导、转化、传递过程以及病毒和细胞基因的表达、凋亡及脂质代谢等[16-17]。目前，有关BVDV Core蛋白功能方面的研究很少，宫晓炜[18]首次提出了BVDV core蛋白与PIAS4结合有利于病毒复制和增殖，但引起这一现象的具体机制还需要深入的研究。因此，为了进一步阐明BVDV Core蛋白在病毒持续性感染和抑制机体免疫应答机理中的功能作用，需要建立Core的检测工具。

本研究选择大肠埃希菌表达系统，因该系统操作简单、表达量高和低成本等优点，常用来表达各种蛋白[19]；选用Pet30a原核表达载体，其带有融合序列较短的His标签，能提高融合蛋白的表达量，便于后续蛋白纯度检测。本研究成功扩增出Core基因片段，构建了原核表达重组载体Pet30a-Core，该载体能大量表达融合蛋白Core蛋白，且蛋白以包涵体的形式存在，可能与其快速表达、体外缺少相关酶修饰等有关；由于Pet30a载体在Core蛋白基因的C端引入His标签，利用阳离子(镍离子)原理对Core蛋白进行纯化，获得了高纯度的目的蛋白。将蛋白免疫兔子后采集血清，使用间接ELISA的方法测定多抗效价高于1∶512 000，也证实Pet30a重组载体表达的蛋白具有较好的免疫原性[20]。Western blot结果显示，多克隆抗体仍能很好的识别BVDV感染牛肾细胞后表达的Core蛋白。IFA检测结果显示，抗体能识别Core蛋白的天然构象表位，说明具有类似天然构象结构。

本研究利用大肠埃希菌原核表达系统成功表达了BVDV Core蛋白，并进行了纯化和透析，得到大量高纯度Core蛋白，且制备了针对Core蛋白的多克隆抗体。通过Western-blot和IFA检测细胞中感染的病毒粒子和表达的病毒蛋白，证明制备的兔抗Core多克隆抗体具有很强的亲和力，为下一步研究该蛋白的功能提供了良好的生物材料。