广西HBV相关肝细胞癌及其癌旁组织中HBV S基因突变分析

李红 吴玲红 邓伟 黄有全 韩箫 梁善雄 黄天壬，

作者单位：530021 南宁 1广西医科大学；2广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部；3广西壮族自治区肿瘤防治研究所

原发性肝癌（以下简称肝癌）是全球第4大癌症死亡原因［1］。2015年广西肝癌发病和死亡例数分别位居恶性肿瘤发病和死亡的第2位和第1位［2］。肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）占肝癌的 75%～85%［1］，是最常见的组织学类型。HCC发生是多因素、多步骤参与的复杂过程，受遗传和环境因素双重影响，其中HBV慢性感染是主要危险因素［3］。据报道，我国乙肝表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）携带者约1.2亿［4］。HBV DNA是由正链和负链组成的不完整双链结构，包含4个开放读码框（open reading frames，ORF），分别为 preS/S 区、preC/C 区、P 区和 X区。ORF突变可改变病毒的复制与毒性，导致病毒持续感染及肝脏严重损伤，甚至可导致HCC发生发展。其中HBV preS/S区由preS1、preS2和S 3个区域组成，编码3种HBsAg，即大分子蛋白（large hepatitis B surface protein，LHBs）、中分子蛋白（middle hepatitis B surface proteins，MHBs）和小分子蛋白（small hepatitis B surface proteins，SHBs）［5］。LHBs由preS1、preS2、S基因编码；MHBs由preS2、S基因编码；SHBs即HBV主蛋白，由S基因编码［6］。近年来，多项研究表明HBVS基因突变与HCC发病密切相关［7-9］。但由于组织样本难以获取，大多研究在血清中进行S基因突变分析。本研究分析肝细胞癌组织HBVS基因及其所编码蛋白的突变情况，为阐明HCC发病机制提供新思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2015年1月至2016年12月于广西医科大学附属肿瘤医院手术切除的43例HCC患者癌组织及其癌旁组织（距手术切缘大于2 cm），均经病理学检查确诊。纳入标准：HBV相关HCC，首次就诊；HBV DNA阳性且定量大于1 000 IU/mL；术前未经抗癌治疗。排除合并其他肿瘤、药物性肝病、酒精性肝病、丙型肝炎病毒感染等患者。共43例患者符合标准纳入研究，其中男性 37例，女性 6例，平均年龄（49.8±10.1）岁，中位年龄50岁（范围：25～69岁）。血清谷丙转氨酶（serum alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate amino transferase，AST）中位水平分别为44.00 U/L 和 51.00 U/L；血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）中位水平为178.4 ng/mL。HBsAg、乙型肝炎E抗原（hapatitis B e antigen，HBeAg）阳性率分别为97.67%和16.28%。本研究经广西医科大学附属医院伦理委员会批准，患者或监护人知情并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 HBV DNA提取 按HBV DNA提取试剂盒（购自上海天根生化科技公司，货号为DP304）说明书提取DNA，NanoDrop2000超微量样本分光光度计检测DNA浓度与纯度。

1.2.2 HBVS基因扩增 采用巢式PCR扩增HBVS基因，全长约586 bp。第一轮反应上游引物为5′-GGGTCACCATATTCTTGGG-3′，下游引物为 5′-GACCCACAATTCTTTGACAT-3′。反应条件：预变性95℃ 2 min；变性95℃ 35 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，共30个循环；终末循环72℃10 min。第二轮反应上游引物为 5′-GCGGGGTTTTTCTTGTTGA-3′，下游引物为5′-GGGACTCAAGATGTTGTACAG-3′。反应条件同第一轮反应。

1.2.3 目的产物鉴定与序列测定 以DNA marker作为对照，10 g/mL琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，目的条带产物由北京六合华大基因股份有限公司进行双向测序。

1.3 序列分析

采用Chromas软件分析序列峰图，鉴定测序结果。DNAMAN软件比对样品序列和NCBI上NC_003977.2 HBV序列；样品序列和NC_003977.2 HBV序列对齐（nt247-771，大小525 bp）进行氨基酸翻译，共175个氨基酸，对应SHBs第31～205位氨基酸。同一位点突变频率超过所有序列数的10%视为热点突变。

1.4 统计学方法

采用SPSS 24.0软件进行数据分析。分类数据组间比较采用完全随机设计的χ2检验或Fisher确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV S基因扩增及测序结果

43对HCC癌组织及癌旁组织样本均成功扩增，扩增产物凝胶电泳在586 bp处出现亮条带，与目的片段长度相符，见图1。扩增产物测序后分别获得43条癌组织序列和43条癌旁组织序列。

图1 部分组织样本HBV S基因琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Gel electrophoresis of agarose for HBV S gene

2.2 HBV S基因热点突变

共116个位点发生突变，其中癌组织有96个位点发生突变，癌旁组织有95个位点发生突变。共发现45个热点突变，所有患者癌组织及其癌旁组织序列均检测到热点突变，并非某一组织所特有，任一热点突变在癌组织与癌旁组织中的分布差异无统计学意义（P＞0.05）。其中，癌组织与癌旁组织的所有序列均存在T291A、A292C和C520A突变，见表1。

表1 HBV相关HCC患者癌组织及其癌旁组织的热点突变［n（%）］Tab.1 Analysis of hot spot mutations of HCC and pericarcinoma liver tissues in patients with HBV-related HCC［n（%）］

2.3 HBV SHBs终止突变

用DNAMAN软件行氨基酸翻译，共发现6条序列由于碱基突变发生终止突变，导致SHBs肽链合成提前终止。在43条癌组织序列中，有6条序列发生SHBs终止突变，突变发生率为13.95%（6/43），癌旁组织未发生此突变（0/43），两者突变发生率差异有统计学意义（P＜0.05）。在 6条序列中，编码第69位、74位、94位、172位和182位氨基酸的密码子突变为终止密码子，导致SHBs截短性变异，见表2。

3 讨论

HBV是突变频率最高的DNA病毒，因为HBV DNA在复制过程中缺乏DNA酶的校正功能［10］。S区与P区完全重叠，长期使用核苷（酸）类似物［nucleos（t）ide Analogues，NAs］引起的耐药突变可间接导致S基因突变，S基因突变也可引起P区基因组突变［11］，HBsAg蛋白氨基酸变异也可影响病毒对药物的反应［12］。在SHBs中，第99～169位氨基酸序列区构成了SHBs的主要亲水区（major hydrophilic region，MHR），其中包括“α 决定簇（aa124～147）”。α 决定簇是重要的抗原决定表位，可刺激B细胞产生中和性抗体，S基因MHR氨基酸的替换降低了乙肝表面抗体的结合，导致免疫逃逸［13］和隐匿性HBV感染（occult hepatitis B virus infection，OBI）。sG145R 突变是S基因最常见的突变，已被证实具有复制能力，可以长期稳定存在，并垂直或水平传播［14-17］。sG145R、sK122I和其他发生在SHBs α决定簇中的免疫逃逸突变，如sT123N突变，可能影响HBsAg分泌［18-19］。S基因MHR逃逸突变可能阻碍HBsAg的表达分泌，使HBsAg汇集在肝细胞内，对细胞产生毒性效应，导致肝损伤，从而促进HCC发病［10］。本研究发现 T291A、A292C、C520A在HCC癌组织与癌旁组织所有序列中均发生突变，而C520A/G521A双突变存在于癌组织的全部序列中，且C520A、G521A突变在MHR内，提示C520A/G521A突变可能造成免疫逃逸，影响HBsAg持续分泌，从而促进HCC发生发展。然而HCC癌组织与癌旁组织热点突变发生率差异无统计学意义，同一患者中，HBVS基因热点突变在HCC癌组织及其癌旁组织中的分布并无特异性。这一结果可能由于S基因处于HBV基因组高度保守区导致，也可能由于抽样误差或样本量较少等原因造成。

表2HCC癌组织中SHBs蛋白终止突变的特点Tab.2 Characteristics of SHBs stop mutation in HCC tissues

本研究还发现SHBs终止突变仅发生在HCC癌组织中，但癌旁组织未发生此突变，6条序列中5个位点发生了终止突变，分别是 sC69*、sW74*、sL94*、sW172*和 sW182*。其中 sC69*、sW172*和 sW182*已有研究报道［8，20-21］，但 sW74*、sL94*突变尚未见报道，提示sW74*、sL94*可能是地域性特有的终止突变模式。终止突变主要由于RT区耐药突变，使S基因发生突变［20］，导致SHBs截短。终止突变也可在自然条件下发生，但未接受核苷（酸）类药物治疗患者突变检出率较低［22］。终止突变可造成免疫逃逸而促进肝脏疾病发生。此外，截短的蛋白质在内质网中滞留而诱发内质网应激反应，如HBV sW172*截短变异体可导致HBsAg分泌缺陷，HBsAg在ER内滞留，通过激活ER应激信号通路参与HCC发生［23］。

综上所述，广西HCC癌组织及其癌旁组织HBVS基因热点突变分布无特异性，SHBs终止突变常发生于HCC癌组织中，新发现了sW74*和sL94*终止突变位点，可能与HCC发生发展密切相关，这一结果为广西HCC研究提供新的方向。但鉴于本研究样本量较少，有关结论尚需进一步验证。