CD14启动子-159位点基因多态性与中国朝鲜族2型糖尿病患者下肢动脉硬化的相关性

金 明，郑寿焕，金光明

（延边大学附属医院，吉林 延吉 133000）

下肢动脉硬化（Lower limb arteriosclerosis，LLAS）是2型糖尿病（T2DM）最常见的大血管并发症之一，根据学者研究，T2DM患者发生LLAS并发症的概率最高可达到46%[1]，糖尿病病程5年、5～10年和10年以上者，LLAS发病率分别是22.6%、23%和66.7%[2]。当患者在临床中出现诸如双下肢静息痛、间歇性跛行、缺血性坏疽等症状时，常常表示下肢动脉缺血已经相当严重，此时在临床上治疗方法较为有限。尤其是动脉硬化 （AS）和硬化斑块 （Arteriosclerosis plaques，ASP）形成会引起动脉管腔的狭窄、闭塞，引发下肢缺血缺氧，最终导致下肢坏疽、坏死，这些均为T2DM患者截肢致残，甚至死亡的最重要原因，严重威胁患者的健康。因此，对LLAS进行早期诊断、早期干预极为重要。本课题组经过多年的研究发现[3-5]，CD14启动子-159位点基因多态性与T2DM患者颈动脉硬化、糖尿病肾病及糖尿病视网膜病变这些大血管及微血管病变存在相关性，但对于其与LLAS的关联仍有待研究。延边地区是我国最大的朝鲜族聚集地，而边疆地区少数民族的健康问题一直是党和国家关心的问题，因此在本实验中，我们探讨了CD14启动子-159位点基因多态性在中国延边地区朝鲜族T2DM患者中的分布情况，探讨该位点的基因多态性与朝鲜族T2DM患者发生LLAS的关系，旨在从基因水平上对LLAS的发病进行早期预防、早期治疗，达到造福边疆地区少数民族患者的目的。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象

选取本院住院的朝鲜族T2DM患者268例，其中男153例、女115例，平均年龄（53.60±10.38）岁。以临床上公认的1999年WHO的T2DM诊断标准作为依据。根据彩色多普勒超声结果共筛选出AS患者229例，其中无斑块（ASNP）患者172例，ASP患者57例。

1.1.2 仪器与检查方法

选择西门子公司S2000型多功能彩色多普勒超声诊断仪，选用血管专用浅表探头，频率为7.5 MHz。受检者检查前l h禁烟酒，检查前平卧10 min，打开外周血管动脉条件，取样容积设为5 mm，探头置于双下肢表面，沿血管中央纵切探查，超声波与血流夹角＜60°。仰卧位时扫查股总动脉、股浅动脉，扫查腘动脉时嘱患者采用俯卧位，双下肢伸直，略分开。检查时注意两侧对比，下肢动脉纵切面图像应通过二维超声显示。测量内-中膜厚度（IMT），以IMT≥1 mm作为AS诊断标准，以IMT≥1.5 mm为ASP形成标准[6]（图1）。

1.1.3 临床资料采集

记录受试者年龄、性别、血压、病程、体质量指数（BMI）、吸烟、饮酒与否和实验室检查数据，包括空腹血糖（FBG）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）等。BMI=体质量（kg）/身高（m）2。

1.2 方法

基因型检测：提取DNA后进行PCR扩增，选用Promega公司产品，上游引物为：5，-GCCTCTGACAGTTTATGTAATC-3，下游引物为：5，-GTGCCAACAGATGAGGTTCAC-3。之后取PCR扩增产物10μL，用限制性内切酶AvaⅡ酶切（Promega公司）CD14基因-159位点。反应结束后进行电泳，结果用紫外灯拍摄。

1.3 统计学处理

2 结果

根据Hardy-Weinberg平衡定律，CD14启动子-159位点基因型分布符合遗传平衡定律，符合等位基因频率在人群中的分布。

2.1 CD14基因型分析

CD14 PCR扩增产物经酶切后基因型有3种，CC型（497 bp），CT型（497，353，l44 bp），TT型（353，144 bp）（图2）。测序结果表明该位点存在C-T的基因多态性（图3）。

2.2 ASNP组和ASP组基因多态性分布的比较

将CD14启动子-159位点的CC纯合子基因频率与CT杂合子及TT纯合子基因比较，发现存在统计学差异（χ2=0.027，P＜0.05）（表1）。

表1 ASNP组和ASP组CD14启动子-159位点CC和CT+TT基因型分布比较（例）

2.3 一般临床资料比较

ASP组收缩压（SBP）显著高于ASNP组，（165.55±15.71）mmHg vs（154.78±15.18）mmHg（P＜0.05），但在舒张压（DBP）、年龄、性别、病程、BMI、FBG和血脂方面无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

2.4 ASP危险因素的Logistic回归分析

患者被认为是一个队列，而ASP被用作一个独立变量。年龄、性别、病程、吸烟、饮酒、BMI、SBP、DBP、FBG、TC、TG、C242T突变的存在是Logistic回归的相关变量。表3结果显示，病程和吸烟是ASP的独立危险因素，而C等位基因突变是ASP的风险因素，存在C突变的T2DM患者合并ASP风险增高61%（表3）。

3 讨论

图1 AS和ASP彩色多普勒超声对比图。图1a：内膜厚度为1.2 mm（＜1.5mm），诊断为AS，图1b：内膜厚度为2.1 mm（＞1.5 mm），诊断为ASP。Figure 1.Comparison of AS and ASP in color Doppler ultrasonography.The thickness of the intima-media in the left image is 1.2 mm(＜1.5 mm),diagnosed as AS,the thickness of the intima-media in the right image is 2.1 mm (＞1.5 mm),diagnosed as ASP.

图2 CD14启动子-159位点基因型。M：DNA标记物；1，5：CT基因型；2：CC基因型；3，4，6：TT基因型。图3 CD14启动子-159位点基因型测序图。图3a：CC纯合子，箭头表示突变型；图3b：TT纯合子，箭头表示突变型。Figure 2.CD14 promoter gene-159 genotype.M：DNA marker;1,5：CT genotype;2：CC genotype;3,4,6：TT genotype.Figure 3.The sequencing map of CD14 promoter gene-159 genotype.Figure 3a：CC homozygous genotype,the arrow indicates a mutant;Figure 3b：TT homozygous genotype,and the arrow indicates a mutant type.

表2 ASNP组和ASP组患者各组间临床资料比较

表3 ASP危险因素的Logistic回归分析

T2DM患者主要表现为糖代谢与脂代谢的双重紊乱，其高血糖和高血脂状态会刺激血小板在血管内皮聚集，从而导致血液黏滞度增高，因血流动力学改变引起动脉内皮细胞缺血缺氧，最终破坏内皮的血管屏障功能[7]。在彩色多普勒超声上，主要表现为二维图像上的动脉IMT弥漫性增厚形成AS，严重者形成ASP，当斑块堵塞30%以上管腔时，则会造成管腔狭窄、甚至闭塞。

CD14是革兰阴性细菌细胞壁成分脂多糖（LPS）的受体，其与LPS特异性结合后，可通过Toll样受体-4以及MD2蛋白向下游传递激活信号，从而启动单核-巨噬细胞系统（MPS），并释放多种炎性细胞因子发生一系列反应[8]，加速蛋白质糖化产物的形成并导致其在血管内堆积，引起血管平滑肌细胞的增生和动脉内中膜增厚[9]；其次可引发胶原蛋白Ⅲ过量合成[10]或者直接作用于管壁细胞，血管细胞外基质的大量堆积[11]，引起纤维组织增生及钙质沉着动脉管壁，使内中膜增厚、血栓形成，最终导致AS及ASP形成[12]。

种族和生活环境的差异被认为与疾病差异性密切相关，朝鲜族饮食习惯中盐分含量高，男性喜饮酒、吸烟，这些均被认为是造成T2DM的高风险因素。其具体机制为烟草中的氧自由基等物质，会损伤患者的血管内皮，造成血管活性平衡失调，增加患者血管的僵硬度；另外，烟草中某些成分会导致患者的胆固醇代谢紊乱，引起血管壁胆固醇清除下降，胆固醇不断堆积于动脉壁，加快AS的发展[13]。至于病程与ASP之间存在相关性则更好理解，随着病程的延长，T2DM患者代谢紊乱日益加重，造成大血管病变是疾病发生发展的自然过程。

随着基因研究的迅猛发展，越来越多的学者喜欢从遗传、基因水平解释疾病易感性的不同。在本研究中我们对延边地区朝鲜族T2DM患者CD14启动子-159位点进行了基因型的调查。从结果来看，AS和ASP患者相比较，CD14启动子-159位点CC纯合子基因频率要明显高于CT杂合子及TT纯合子基因，两者之间存在显著差异（P＜0.05）。

根据本研究所示，CD14启动子-159位点基因多态性与中国朝鲜族T2DM患者并发ASP存在相关性，患者中CC纯合子基因是较高的危险因素。因此，通过对高危人群进行基因检测，可以早期发现并排除隐患，及早进行干预治疗，意义重大。而彩色多普勒超声以其价廉、无创、实时可重复等优点，具有广泛的应用前景。但有一点需要注意，操作者术水平是影响检测结果的一个重要因素，因此应提高操作者技术水平，按照标准操作流程进行检查。