紫苏叶挥发油舒张血管作用及其活性物质探究

周勤梅，谯明鸣，彭 成*，敖 慧，熊 亮*，刘 菲

1成都中医药大学药学院 教育部中药材标准化重点实验室 西南特色中药资源国家重点实验室；2成都中医药大学，西南特色药材创新药物成分研究所，成都611137

紫苏叶来源于唇形科植物紫苏Perillafrutescens(L.)Britt.的干燥叶(或带嫩枝)。在我国应用历史悠久，具有解表散寒，行气和胃的传统功效，常用于风寒感冒，咳嗽呕恶，妊娠呕吐，鱼蟹中毒等[1]。由于气味芳香，也常作为香精和调料使用[2,3]，紫苏叶挥发油含量高，约0.2%～1.5%[3]，《中国药典》2015年版中规定药材含挥发油不得少于0.40%。

紫苏全身是宝，其叶、梗、籽都可以药食两用，有助于预防心血管疾病[4]。紫苏子压榨的植物油富含α-亚麻酸，具有调脂、抗动脉硬化作用，对降低心脑血管疾病具有积极意义[5]，从而备受人们亲睐。同样，紫苏叶作为重要的食材，生活中应用颇广，现代药理研究主要集中于其挥发油具有明显的抗病原微生物、抗过敏、抗炎、抗氧化等作用[6-9]，而对于心血管疾病方面的研究鲜有报道。本研究开展了紫苏油舒张血管活性及其活性物质研究，为紫苏叶的应用和推广提供科学内涵。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

肌张力传感器：JH-2型，中国北京航天医学工程研究所；离体组织器官恒温灌流系统：埃德仪器国际贸易(上海)有限公司；气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent 7890A/5975C气相色谱/质谱联用仪；电子分析天平：Sartorius系列，型号BP221S型；优普超纯水制造系统，型号UPT-II-20T，成都超纯科技有限公司；可调式移液器：Thermo Fisher Scinentific。

紫苏叶药材于2017年6月购自于四川省新荷花饮片公司，经成都中医药大学高继海副教授鉴定为紫苏Perillafrutescens的干燥叶。紫苏醛标准品(纯度≥98%)，由成都化夏化学试剂有限公司提供，批号：253466。Acetycholine chloride：Bomei；二甲亚砜(DMSO)：成都科龙试剂厂，分析纯，批号：2015110201；NaCl，KCl，KH2PO4，MgSO4，NaHCO3，Glucose，EDTA，CaCl2均为分析纯，购自成都科隆化学品有限公司。

1.2 实验动物

SD大鼠，清洁级，雌雄不限，体重200±20 g，由成都中医药大学实验动物研究中心提供。动物生产许可证号：SCXK(川)2013-24，检疫后用。饲养温度21～27 ℃，湿度50%±5%，昼夜光照及通风环境自然调节。

1.3 挥发油的提取

取紫苏叶药材500 g，参照《中国药典》2015年版紫苏叶项下挥发油提取方法[1](水蒸气蒸馏法)得到紫苏叶挥发油2.2 mL，经无水硫酸钠干燥除水后，贮存于4 ℃冰箱，备用。

1.4 舒张血管活性筛选

1.4.1 溶液的配制

K-H溶液配制：称取NaCl 6.92 g，KCl 0.35 g，KH2PO40.16 g，MgSO40.14 g，NaHCO32.1 g，Glucose 1.82 g，EDTA 0.009 g，CaCl20.28 g，加入纯水，溶解并定容于1 000 mL量瓶中，现用现配。

样品溶液的配制：精密称取紫苏油适量，加二甲基亚砜配制成40 mg/mL的母液，备用。实验中采取累积给药方式，加入K-H溶液的浴槽中，使其在浴槽中的终浓度分别0.2、0.7、2、7、20 μg/mL。实验中其他若非特别说明，则以去离子水为溶剂。

1.4.2 大鼠胸主动脉血管环的制备

大鼠脱颈椎处死，迅速打开胸腔，快速取出胸主动脉，并置于O2饱和4 ℃ K-H液(pH=7.4)中，剔除周围的结缔组织，冲洗血管内血液，剪成3～5 mm的血管环。血管环用两根不锈钢蹬型挂钩水平悬挂于浴管内，一端固定于浴管内，另一端连接张力换能器，调节1 g的基础张力，采用离体组织灌流模型和PowerLab数据分析系统采集和记录离体血管环张力的变化。浴槽内含有K-H液，温度恒定在37 ℃，持续通95%O2+5%CO2混合气体，平衡60 min，每15 min换37 ℃ K-H液。

1.4.3 血管环活性检测

在开始实验前，采用KCl(60 mmol/L)预收缩血管环，当收缩张力达到坪值后，往浴槽内加入Ach(10 μmol/L)舒张血管环，连续刺激3次。每次刺激后，K-H液连续冲洗三次，每次5 min，恢复到基础状态后，稳定30 min。当连续的两次收缩或舒张幅度小于10%，认为血管环组织结构完整，血管环活性良好，可重复实验。

1.4.4 紫苏叶油以及单体化合物对KCl收缩曲线影响检测

待血管环平衡60 min后，用KCl(60 mmol/L)连续刺激血管环至少2～3次。每次刺激后，K-H液连续冲洗三次，每次5 min，恢复到基础状态后，稳定30 min。当连续相同刺激所引起的血管收缩幅度小于10%，往浴槽内加入KCl(60 mmol/L)预收缩胸主动脉环，血管收缩张力达到坪值时，累积加入5个浓度的紫苏叶挥发油，观察浓度与舒张效应曲线，比较不同浓度下紫苏叶挥发油对KCl(60 mmol/L)预收缩血管环的舒张作用。同法，对单体化合物紫苏醛(依次为0.5、1.5、5、15、50 μmol/L)进行活性筛选，比较不同浓度下对KCl(60 mmol/L)预收缩血管环的影响。

1.4.5 数据统计

以KCl(60 mmol/L)所致的最大收缩张力为100%，计算各浓度挥发油所致的舒张百分比(%)。采用血管张力值变化反映药物的舒张作用，单位为g。实验数据以mean±SEM表示(n=6)，组间比较采用t检验，SPSS 18.0统计完成(P<0.05，有显著性差异；P<0.01，有极显著性差异)。化合物的浓度依赖舒张效应曲线图采用Graphpad Prism 5软件完成(以不同给药浓度下最大舒张率为纵坐标，累积给药浓度的对数值为横坐标)。

1.5 GC-MS分析

为进一步分析紫苏油发挥抗血管生成活性的物质组成，本实验采用了气质联用技术(GC-MS)对其进行分析。方法参照气相色谱法(中国药典2015版二部附录V E)测定。

1.5.1 色谱条件

色谱柱为HP-5 MS型石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱流量1.0 ml/min，载气为高纯度氦气(99.999%)，柱前压7.65 psi。程序升温：初始温度60 ℃，以每分钟10 ℃的速率升温至90 ℃，以每分钟2 ℃的速率升温至180 ℃，进样口温度280 ℃，分流比20∶1。离子源为EI源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量70 eV，发射电流34.6 μA，质量范围20～800 amu。

1.5.2 GC-MS数据处理

通过Agilent 5975C MSD化学工作站检索Nist 14.0标准质谱图库，同时结合有关质谱图文献解析，对紫苏叶油中的化学成分进行鉴定。通过Agilent 5975C MSD化学工作站数据处理系统，按峰面积归一化法计算求出各化学成分的峰面积相对百分含量。

2 结果与分析

2.1 紫苏叶油对KCl预收缩血管环的影响

实验中以DMSO为空白溶剂，可以看出其对血管舒张无明显影响(见图1)。本实验选择Methoxyverapamil作为KCl诱导血管环收缩模型的阳性对照药，维拉帕米(verapamil)是常见的治疗高血压、心率失常、心绞痛的药物，其作用机制为阻断钙离子通道[10-11]，观察其对KCl诱导血管环收缩张力的影响。按照累积给药方式，Methoxyverapamil对KCl诱导血管环收模型具有明显的舒张作用，EC50为0.69 μmol/L。

紫苏叶挥发油对KCl预收缩的离体大鼠胸主动脉环具有良好的舒张作用，在0.2～20 μg/mL剂量范围内呈依赖性，其EC50为8.6 μg/mL。KCl通过高K+去极化，使细胞膜上的VDCCs开放，外钙内流，细胞内游离Ca2+浓度升高，血管平滑肌出现收缩[12]。因此紫苏叶挥发油舒张血管作用可能是通过影响KCl导致的VDCCs开放，减少胞外Ca2+的内流而实现。

图1 空白溶剂、阳性药以及紫苏叶挥发油对KCl预收缩胸主动脉环的舒张量效曲线Fig.1 Vasorelaxant activity of solvent,methoxyverapamil and the volatile oil against KCl-induced 注：与空白溶剂组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:Compared with control group,*P < 0.05,**P < 0.01.

2.2 紫苏油活性部位的化学组成

采用GC-MS对紫苏挥发油进行分析，发现水蒸气蒸馏法提取的紫苏叶挥发油含量及主要成分相对百分含量见表1；按上述色谱条件进样得到挥发油的总离子流色谱图见图2。

表1 紫苏叶挥发油化学成分及其相对百分含量Table 1 Chemical constituents and relative percentages of volatile oil from Perilla leaves

续表1(Continued Tab.1)

峰号No.保留时间tR(min)化合物Compound分子式Molecular formula分子量Molecular weight相对百分含量Relative percentage (%)49.706香薷酮 Elsholtzia ketoneC10H14O21662.70510.583未鉴定 Unknown--0.57611.6501-(呋喃-2-基)-4-甲基戊-1-酮 1-(Furan-2-yl)-4-methylpentan-1-oneC10H14O216622.18712.744紫苏醛 PerillaldehydeC10H14O15037.15813.480未鉴定 Unknown--1.13913.865未鉴定 Unknown--10.661019.320石竹烯 CaryophylleneC15H242045.971121.032α-律草烯 α-HumuleneC15H242040.591223.4532,6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯基)双环[3.1.1]庚-2-烯2,6-Dimethyl-6-(4-methyl-3-pentenyl)bicyclo[3.1.1]hept-2-eneC15H242042.561327.806氧化石竹烯 Caryophyllene oxideC15H24O2202.991429.030未鉴定 Unknown0.461530.516δ-芹子烯 δ-SelineneC15H242040.821631.464β-桉叶醇 β-Eudesmol1.361731.618α-桉叶醇 α-EudesmolC15H26O2221.37

紫苏由于产地的不同其化学组成存在显著性差异[13,14]，结合GC-MS法对紫苏油进行化学组成分析发现，本实验中的活性部位紫苏叶油中主要含有单萜和倍半萜类成分，且紫苏醛为其代表性成分(含量为37.15%)，提示紫苏油发挥舒张血管活性可能与该成分密切相关。

图2 紫苏叶挥发油的总离子流Fig.2 Total ion current chromatography of the volatile oil from Perilla leaves

2.3 主要成分紫苏醛的舒张血管活性的评价

本实验进一步选择紫苏叶挥发油中的主要代表性单萜紫苏醛进行研究，观察其对KCl预收缩胸主动脉环的活性影响，以浓度与效应绘制曲线，结果发现累积给药加入紫苏醛，对KCl(60 mmol/L)预收缩血管环的表现出一定的舒张作用，当浓度为50 μmol/L时，最大舒张率为35.3%±8.6%，结果见图3。

3 结论

挥发油是从植物中提取的挥发性芳香物质。本实验采用水蒸气蒸馏法提取紫苏叶挥发油，该方法适用于具有芳香性成分(萜类或芳香族类)的提取，与文献报道一致[13,14]。而来源于该植物的种子紫苏子因脂肪油含量较高，常采用压榨法进行提取，其挥发性和芳香性较弱，以α-亚麻酸为代表的脂肪酸类成分常常需要甲酯化后才能进行检测[15,16]。因此，挥发油提取方法的选择与药用部位所含成分的性质密切相关。

目前，大量研究表明植物挥发油对心血管具有明显的作用[17]。紫苏叶是药食同源的，现代药理研究主要集中在抑菌、抗肿瘤、抗氧化、提高免疫功能等方面，本研究首次证实紫苏叶挥发油具有显著的舒张血管的作用。经GC-MS联用技术分析该活性部位，发现紫苏叶油中主要含有单萜类和倍半萜类，提示萜类成分可能是其主要的活性物质。为进一步追踪药效物质，本研究选择含量较高的单萜类成分紫苏醛(含量为37.15%)进行筛选，结果发现紫苏醛具有一定的舒张缩血管作用，当浓度为50 μM时，最大舒张率为35.3%，表明紫苏醛是紫苏叶油舒张血管的重要活性成分之一。

图3 紫苏醛对KCl预收缩胸主动脉环的 舒张量效曲线Fig.3 Vasorelaxant activity of perillaldehyde against 注：与空白溶剂组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:Com- pared with control group,*P < 0.05,**P < 0.01.

经大量文献查阅，发现紫苏叶挥发油中单萜类成分右旋柠檬烯(D-limonene，含量7.86%)和芳樟醇(linalool，含量1.47%)具有舒张血管的作用。二者均是常见的单萜类化合物，其中，右旋柠檬烯是柑橘类(橙，柠檬，金橘和柚子等)精油的主要成分[18]。学者Touvay等[19]研究了右旋柠檬烯对野百合碱(MCT)诱导的大鼠的肺动脉高压和右心室肥厚的影响，每日口服400 mg/只给药大鼠，右旋柠檬烯均能显著降低MCT引起的大鼠肺动脉高压和右心室肥厚，此外还能降低肺动脉中膜厚度。芳樟醇通常为外消旋混合物，存在于多种草本植物中，在化妆品和食品行业常被用作香水和香料[20]。Höferl等[21]研究探讨芳樟醇对血压的影响，发现该单萜对人体心血管系统具有明显的影响。综上所述，紫苏叶挥发油发挥舒张血管作用的物质基础主要是单萜类成分，其显著的药效可能与多活性成分的协同作用有关，具体有待进一步研究。