茶皂素提取条件的优化及纯化研究

孙万里

(江西省宜春学院 化学与生物工程学院, 江西 宜春 336000)

茶皂素又称茶皂苷，是一类天然糖苷化合物，茶皂素主要来源于油茶(CamelliaoleiferaAbel)，具有一般皂苷的通性，茶皂素难溶于无水甲醇、无水乙醇、冷水，且不溶于丙酮、苯、乙醚、石油醚等有机溶剂[1]，易溶于含水甲醇和乙醇，是一种非离子型极性物质，其分子中有亲水性的糖体和疏水性的配位基团，具有乳化、分散、润湿、发泡、去污等功能和溶血、抗菌、抗病毒、降血脂等生理活性[2-4]。因此，茶皂素在日用化工、农药、医药、食品等领域具有广泛的应用价值。

目前，茶皂素的提取方法主要有2种：一是水提法[5]，利用茶皂素溶于热水的性质，选取热水作为浸提剂从而将茶皂素提取出来。水提法虽然简单易操作，但是浸出的成分复杂，不利于后续分离纯化，且耗能较多；二是有机溶剂提取，有乙醇、甲醇提取法等，这2种方法中乙醇的安全性更高，甲醇毒性大，且甲醇提取过程中带入的杂质较多，导致产品纯度降低[6-7]。杨坤国等[8]尝试用无水乙醇回流提取茶籽中茶皂素，趁热过滤，使得粗产品和原料迅速分离，提取收率为9.7%、纯度80.1%的茶皂素。

初步提取的茶皂素含有多酚类化合物、多糖类、植物色素和粗脂肪、粗纤维等杂质，需要进一步纯化，才能达到一定的纯度。目前，如何进一步提高茶皂素纯度和降低提取费用仍然是一个有待解决的问题。分离纯化茶皂素的方法有沉淀、溶剂萃取、膜分离、硅胶柱层析、高速逆流色谱分离以及大孔吸附树脂分离等，其中采用大孔树脂吸附法[9]或超滤膜法[10]来纯化茶皂素被认为是一种具有巨大推广价值的方法，在树脂吸附后，通过水洗、碱洗和醇洗等步骤可以有效地将茶皂素与杂质进行分离。有报道表示采用大孔吸附树脂吸附法提取的茶皂素收率、纯度和色泽等指标都明显高于传统工艺所制得的茶皂素[11]。因此，本研究采用油茶茶籽饼为原料，经乙醇水溶液提取茶皂素后，用大孔树脂NKA-9纯化茶皂素进行前期提取和纯化的初步研究，以期为茶皂素开发利用提供基础数据。

1 实 验

1.1 材料、试剂与仪器

油茶茶籽饼由江西青龙高科集团提供；NKA-9型大孔树脂购于天津南开波鸿树脂科技有限公司；无水乙醇(纯度99.5%)、石油醚(沸程60～90 ℃)、香草醛(纯度99%)、茶皂素标准品(纯度98%)。

BZ40138索式提取器，上海洪纪仪器设备有限公司；722-100型可见分光光度计，上海天普分析仪器仪表有限公司；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵；RE-3000旋转蒸发仪。

1.2 茶皂素的提取

1.2.1原料预处理 取一定量的茶籽饼，粉碎，于恒温干燥箱中在60 ℃下干燥4 h或以上，控制茶籽粉的水分≤5%。过筛筛分出粒径0.4 mm茶籽粉，加入一定量的石油醚经索式抽提器抽提4～6 h，直至抽提液无色，其目的是除去油脂以防后续干扰[12]。将经脱脂处理过的茶籽粉置于通风良好处自然风干，后于干燥箱中60 ℃条件下干燥4 h烘干备用。

1.2.2标准曲线的建立 采用香草醛-浓硫酸显色法[13]检测茶皂素的含量。首先，准确称取茶皂素标准品0.04 g，用体积分数80%乙醇溶液将其溶解于20 mL容量瓶中，定容至刻度后摇匀，得到茶皂素质量浓度为2 g/L的标准溶液。然后，准确称取8 g香草醛于100 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，配制香草醛乙醇溶液。用移液枪精密移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL茶皂素标准溶液分别放置于5个比色管中，加入蒸馏水直到溶液体积均为0.5 mL，精密加入香草醛乙醇溶液0.5 mL，并将比色管置于冰水混合物中，分别移取4 mL 77%浓硫酸于比色管中，摇匀。将比色管置于60 ℃恒温水浴锅中水浴15 min，再将其置于冰水混合物中反应10 min，取出恢复至室温。取配置好的样品溶液，以空白试剂为对照，在波长550 nm处测定吸光度(A)，以A为纵坐标，茶皂素标准品溶液质量浓度(x, g/L)为横坐标作标准曲线，得标准曲线方程:A=0.904x+0.007 7,相关系数R2=0.997 8。

1.2.3提取流程及优化 准确称取2 g经脱脂处理的茶籽粉于250 mL锥形瓶中，以一定体积的不同体积分数的乙醇水溶液作为浸提液，在一定温度下恒温水浴浸提一定时间，在λ=550 nm处分别测定A，由标准曲线方程换算成浸提液中茶皂素质量浓度，进而算出得率。分别考察料液比、浸提液乙醇体积分数、浸提温度、浸提时间对茶皂素得率的影响，从而选出最佳的工艺条件。提取得率(y)计算公式：y=C×V/m×100%(其中，C为浸提液中茶皂素质量浓度，g/L;V为浸提液体积,mL;m为原料的质量,g)。

1.3 大孔树脂NKA-9纯化茶皂素

1.3.1茶皂素粗提液的制备 将最佳单因素提取试验所得提取液经过滤，滤液经旋转蒸发回收乙醇，真空干燥，可得到粗茶皂素。准确称取1 g粗茶皂素用热水溶解，然后进行抽滤以除去不溶物质，再用蒸馏水定容至1 000 mL容量瓶中，备用。

1.3.2大孔吸附树脂预处理 将NKA-9型大孔吸附树脂放于无水乙醇中浸泡8 h，除去醇溶物，然后用蒸馏水反复洗涤至无醇味。在5%的盐酸中浸泡3 h，用蒸馏水洗至中性，再用5% NaOH溶液浸泡3 h，蒸馏水洗至中性，备用[14]。

1.3.3静态吸附与解吸

1.3.3.1吸附时间的影响 准确称取2 g预处理过的NKA-9树脂置于250 mL锥形瓶中，加入50 mL 1 g/L茶皂素粗提液，树脂吸附前皂茶素的质量浓度(C0)为0.667 g/L，温度为37 ℃，摇床转速140 r/min条件下振荡 3 h，每30 min测一次溶液中茶皂素的质量浓度，按式(1)和(2)计算吸附量和吸附率：

Q=(C0-C′)×V′/m′

(1)

W=(C0-C′)/C0×100%

(2)

式中：Q—吸附量，mg/g；W—吸附率，%；C0—吸附前茶皂素的质量浓度，g/L；C′—吸附后粗提液中残余茶皂素的质量浓度，g/L；V′—茶皂素粗提液的体积，mL；m′ —大孔吸附树脂的质量，g。

(3)

式中：D—解吸率，%；C1—解吸后解吸液中茶皂素的质量浓度，g/L。

1.3.4动态吸附与解吸 称取一定量的预处理好的NKA-9型树脂湿法上柱，将质量浓度1 g/L的茶皂素粗提液上样，控制一定的流速，上样完毕，用50 mL的蒸馏水洗，水洗后再用一定量不同体积分数的乙醇溶液进行洗脱，控制一定的洗脱流速，测定洗脱液中茶皂素的质量浓度。茶皂素纯度由洗脱液中茶皂素与干物质的质量比值计算得到。

2 结果与讨论

表1 不同浸提条件对茶皂素得率的影响

2.1 浸提条件对茶皂素得率的影响

2.1.1料液比 考察不同料液比对茶皂素得率的影响，以体积分数95%乙醇水溶液为浸提液，60 ℃恒温水浴浸提2 h，结果见表1。由表可知随着料液比的减小，茶皂素得率随之增大，而到了料液比 1∶11(g ∶mL，下同)时，茶皂素得率反而下降，可能是茶皂素提取过程中，需要一定量的提取剂才能完全渗透至原料的微孔中，进而溶解出茶皂素，而料液比1∶11时，茶皂素得率下降，可能是由于浸提液过多，稀释了茶皂素的缘故。考虑到能耗及得率，确定最佳料液比为1∶9。

2.1.2乙醇体积分数 考察不同的乙醇体积分数对茶皂素得率的影响，料液比为1∶9，60 ℃恒温水浴浸提2 h，结果见表1。由表可知,乙醇体积分数小于60%时，可能是乙醇浓度小，含水较多，达不到应有的浸取效果，故浸提液中茶皂素质量浓度不高，以体积分数50%乙醇水溶液浸提得率为11.3%,而乙醇体积分数为60%时，茶皂素得率最高达到11.8%，由此确定最佳浸提液体积分数为60%乙醇水溶液。随着乙醇体积分数逐渐增大，茶皂素的质量浓度反而降低，可能是茶皂素不溶于无水乙醇，浸提液中含醇较多的缘故。

2.1.3浸提温度 考察不同的浸提温度对茶皂素得率的影响，料液比为1∶9，以体积分数60%乙醇水溶液为浸提液，浸提时间2 h，结果见表1。从表中可知从50到80 ℃这一段，茶皂素得率变化不大，而90 ℃时，茶皂素得率突增，可以解释为温度过高，乙醇挥发导致浸提液量变少，在时间一定的前提下，90 ℃ 时的浸提液量少，导致其中的茶皂素质量浓度过高。从能耗角度考虑，确定60 ℃为最佳的浸提温度。

2.1.4浸提时间 考察不同的浸提时间对茶皂素得率的影响，料液比为1∶9，以体积分数60%乙醇水溶液为浸提液，浸提温度60 ℃，结果见表1。由表可知，随着时间的递增，茶皂素得率呈现先上升后下降的趋势，先上升可能是茶皂素从原料中渗透出来至浸提液中需要一定的时间所致，后下降可能是时间长了茶皂素易失活的缘故，故最佳的浸提时间为3 h，此时茶皂素得率最高为14.9%。

综上所述，在单因素试验中，提取茶皂素最佳的工艺条件为液料比1∶9(g ∶mL)，浸提液乙醇体积分数60%，浸提温度60 ℃，浸提时间3 h，此时茶皂素得率最高可达到14.9%,浸提液茶皂素纯度为67%。

2.2 NKA-9型树脂静态吸附和解吸

2.2.1静态吸附动力学 静态吸附时间对吸附量的影响见图1。根据图1可知，NKA-9型树脂在0～2 h内，其吸附量随时间增加而迅速增大，吸附0.5 h 基本饱和，2 h以后吸附量的增加趋于缓慢。由此可以看出，NKA-9型树脂是一种快速吸附型树脂，这对实际生产中的应用极为有利，将极大提高生产效率，同时得到NKA-9型树脂实验所得最大吸附量为10.73 mg/g。

2.2.2洗脱剂体积分数对解吸效果的影响 不同洗脱剂体积分数对静态吸附效果的影响见图2。根据图2可知，茶皂素的解吸率与乙醇体积分数成正相关，体积分数70%和80%的乙醇静态解吸率分别为83%和91.1%。从经济性角度考虑，可选择体积分数70%乙醇为适宜的洗脱剂，如果从解吸效果来考虑，可选用体积分数80%乙醇进行洗脱。

图1 NKA-9型树脂静态吸附动力学曲线

图2 乙醇体积分数对静态解吸率的影响

2.3 NKA-9型树脂动态吸附

2.3.1泄露曲线 由于树脂吸附容量一定，当大孔树脂吸附达到一定容量时，其对物质的吸附减弱甚至消失[15]，因此动态吸附选择合适的上样量是树脂纯化技术的关键，而泄露曲线就是为了选择合适的上样量。实验结果从图3可以看出，上样量到25～50 mL之间，流出液中茶皂素质量浓度呈大幅上升趋势，50到125 mL之间，幅度减小，125 mL 之后，流出液茶皂素质量浓度趋于平缓，可能是树脂达到了吸附饱和状态。考虑到尽量接近树脂的吸附容量，因此选择125 mL上样量最为合适。

2.3.2上样流速对吸附率的影响 上样流速对吸附率的影响如图4所示。由图4可知，吸附率与上样流速成反比，可以认为流速变大，茶皂素在树脂内的扩散速度变慢，导致吸附率减小。当上样流速为2.5 mL/min时，吸附率最大为73.58%，2.5～6.5 mL/min时，吸附率没有明显减小，而当上样流速为8 mL/min时，吸附率下降到66.04%，此后吸附率随上样流速的增加而下降平缓，考虑到吸附稳定性，故选择上样流速为8 mL/min较为合适。

图3 NKA-9树脂的泄露曲线

图4 上样流速对吸附率的影响

图5 不同乙醇体积分数动态洗脱效果

2.4 洗脱条件对动态洗脱效果的影响

2.4.1洗脱剂乙醇体积分数 乙醇是一种较为安全且比较常用的洗脱剂，能够使树脂产生溶胀作用，降低树脂与被吸附物质之间的作用力(范德华力或生成氢键)，使树脂上的被吸附物质容易解吸下来[16-17]。在洗脱流速5 mL/min时，洗脱剂用量60 mL时，不同的乙醇体积分数洗脱效果如图5。从图5可以看出体积分数40%、50%、60%乙醇洗脱效果增速较慢，从体积分数60%乙醇洗脱开始，洗脱液中茶皂素质量浓度随之增加较快，到90%乙醇洗脱时茶皂素质量浓度达到最高，可能是乙醇浓度越高，对树脂的溶胀作用更好，洗脱效果也更好的缘故，从经济角度考虑，选用体积分数为80%的乙醇作为后续洗脱条件的研究。

2.4.2洗脱剂用量 在洗脱流速5 mL/min时，洗脱剂用量对洗脱效果的影响见图6。由图6可知，体积分数90%的乙醇只洗脱部分茶皂素，且峰形跟80%乙醇对比较为不对称，有拖尾现象发生;反观80%乙醇洗脱较为集中且峰形对称，50 mL洗脱剂用量能使洗脱液中茶皂素质量浓度达到1.57 g/L，可能是洗脱剂用量50 mL时左右时恰好能把树脂上吸附的茶皂素洗脱下来，而过多的洗脱剂会稀释洗脱液中的茶皂素的含量，过少的洗脱剂无法把树脂上吸附的茶皂素洗脱下来的缘故。因此，选择体积分数80%乙醇进行动态洗脱，用量为50 mL。

图6 NKA-9型树脂的动态解吸曲线

图7 不同洗脱流速对洗脱效果的影响

2.4.3洗脱流速 用80%乙醇作为洗脱剂，在不同洗脱剂用量的情况下，3种洗脱流速的实验结果见图7。3种洗脱流速、洗脱效果都是随洗脱剂用量的增加呈现先上升后下降的趋势，洗脱剂用量50 mL最好，与2.4.2节实验结果一致；流速10 mL/min时洗脱有拖尾现象发生;流速15 mL/min时峰形略宽，洗脱不彻底。综合来看，洗脱流速5 mL/min时最佳。在以体积分数80%乙醇，洗脱流速5 mL/min，用量50 mL进行洗脱，洗脱液中茶皂素质量浓度为1.25 g/L，洗脱液经干燥得茶皂素纯品纯度95%。

李明静等[18]和曹万新等[19]对大孔吸附树脂法和传统的有机溶剂萃取法进行比较研究发现工艺较为简单，得到的茶皂素产品颜色浅，纯度在90%左右，这和本研究的结果基本一致，且本研究纯化得到的茶皂素纯度更高，为95%。因此NKA-9大孔树脂是一种比较好的纯化茶皂素树脂。

3 结 论

3.1采用茶籽饼为原料，乙醇为提取剂，提取茶皂素的最佳工艺条件为料液比1∶9(g ∶mL)，乙醇体积分数60%，提取温度60 ℃和提取时间为3 h,在此条件下提取得率14.9%。

3.2采用大孔吸附树脂NKA-9对茶皂素粗品静态吸附实验表明：在0.5 h之内，树脂基本达到饱和，说明NKA-9大孔树脂是一种快速吸附型树脂；吸附时间3 h时，吸附量可达到10.73 mg/g，表明树脂的吸附效果较好。用80%体积分数的乙醇进行解吸实验解吸率最大能达到91.1%，表明NKA-9树脂具有良好的洗脱性能。

3.3对NKA-9树脂的动态吸附与解吸进行研究，实验表明进行动态吸附时NKA-9树脂上样量125 mL和上样流速8 mL/min较佳，吸附率为66.04%。洗脱实验结果表明：洗脱时以体积分数80%乙醇、乙醇用量50 mL进行洗脱，洗脱流速为5 mL/min时效果较好，这时洗脱液中茶皂素质量浓度在1.25～1.57 g/L之间，洗脱液经干燥得茶皂素纯品纯度为95%。