ClassⅠ新城疫病毒单克隆抗体的制备

杨少华　张琳　崔宁　黄庆华　黄艳艳　许传田

摘要：本试验以纯化的新城疫病毒（NDV）弱毒株D58为免疫原免疫6～8周龄BALB/c小鼠，分离脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，经多次ELISA鉴定和血凝抑制试验（HI）筛选和亚克隆培养，获得了4株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞并制备了单抗。经鉴定，4株单抗均有ELISA效价，其中1株单抗有中和活性和HI活性，只与ClassⅠNDV反应，与ClassⅡNDV不反应。该单抗与不同群NDV反应的差异性为NDV的鉴别诊断和不同毒株抗原差异性研究奠定了一定基础。

关键词：鸡;新城疫病毒;单克隆抗体;HN蛋白

中图分类号：S852.65+7文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）10-0135-04

Preparation of Monoclonal Antibody against

Class Ⅰ Newcastle Disease Virus

Yang Shaohua， Zhang Lin， Cui Ning， Huang Qinghua， Huang Yanyan， Xu Chuantian

（Institute of Animal Science and Veterinary Medicine， Shandong Academy of Agricultural

Sciences/Shandong Key Lab of Animal Disease Control and Breeding， Jinan 250100， China）

Abstract The lentogenic NDV D58 strain purified by differential centrifugation was immunized to 6～8-week BALB/c mice. The spleen cells of the mice were hybridized with SP2/0 three days after the last immunization. After screened by indirect ELISA and HI assay， and cloned by limiting dilution， four hybridoma cells secreting antibodies stably were obtained and the monoclonal antibodies were prepared. All four McAbs had ELISA titers， and one of them had neutralization and HI activities and could react with ClassⅠNDV specifically. The differences of the reaction between McAb and different groups of NDV lays a foundation for the clinical identification of NDV and the differential study of antigens in different strains of NDV.

KeywordsChicken; Newcastle disease virus; Monoclonal antibody; HN protein

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一種禽的急性、高度传染性疾病，国际兽疫局（OIE）将其列为动物A类疫病[1，2]。自1926年被确诊以来，新城疫在世界范围内广泛传播，目前我国由于疫苗的广泛使用，新城疫的发病率逐年降低，但非典型性ND仍零星散发，ClassⅠ弱毒株在禽群中广泛存在[3-5]。ClassⅠ毒株在鸡群中存在毒力返强和散毒的风险，因此有必要加强鸡群中此类毒株的监测。

尽管NDV只有一个血清型，但不同亚型的病毒间存在较大的抗原差异。单克隆抗体具有针对单个抗原决定簇的特异性，可以识别不同的抗原位点，因此可以用来检测不同毒株之间的抗原差异。本研究以纯化的ClassⅠNDV弱毒株为免疫原，拟研制具有中和活性和血凝抑制活性的单抗，以期为NDV的鉴别诊断和抗原差异研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新城疫ClassⅠ弱毒株D58（KF055276）及其它NDV分离株由本实验室分离鉴定并保存;小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0），购自武汉大学细胞保藏中心;鸡胚成纤维细胞（DF1）由本实验室保存;BALB/c小鼠，购自山东大学实验动物中心;9～10日龄SPF鸡胚，购自山东省农业科学院家禽研究所;DMEM培养基、HAT培养基、HT培养基购自Sigma公司。

1.2 主要试剂

新生牛血清、胰酶均由Gibico公司生产;辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠IgG、IgM购自Sigma公司。

1.3 病毒的纯化与浓缩

新城疫病毒D58经稀释液1∶1 000稀释后接种9～10日龄SPF鸡胚，每胚0.2 mL，37℃温箱孵育，弃去24 h内的死亡鸡胚，此时收集尿囊液测病毒效价，96 h后再收集尿囊液测病毒HA效价。尿囊液经三次冻融后在4℃条件下进行离心，3 000 r/min离心30 min，弃沉淀，取上清，8 000 r/min离心30 min，弃沉淀，上清25 000 r/min离心1 h，弃上清，沉淀以适量PBS重悬，20%～50%（w/w）蔗糖连续密度梯度离心，25 000 r/min离心4 h。收集病毒带于透析袋中，透析脱糖，PEG8000浓缩病毒，检测HA效价和蛋白浓度，分装后-70℃保存备用。

1.4 单克隆抗体的制备

1.4.1 免疫BALB/c小鼠以上述提纯的D58病毒为免疫原，腹腔注射免疫6～8周龄BALB/c雌性小鼠，剂量为每只50 μg。首免用弗氏完全佐剂充分乳化病毒抗原，二免至四免用弗氏不完全佐剂乳化病毒抗原，共免疫4次，免疫间隔期为两周。三免一周后，小鼠眼眶采血，测血清抗体效价。四免两周后，选择效价最高的小鼠，以不加佐剂的病毒腹腔注射加强免疫1次，3 d后取小鼠脾脏淋巴细胞与SP2/0细胞融合。

1.4.2 细胞融合取免疫BALB/c小鼠的脾脏淋巴细胞与处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，融合剂为PEG4000，以小鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞，HAT为选择性培养基，分装于96孔细胞培养板，置于5% CO2细胞培养箱中37℃培养，7～10 d后以HT培养基全部置换HAT培养基。逐日观察，待融合的杂交瘤细胞长至孔底十分之一，取细胞上清液检测。

1.4.3 阳性杂交瘤细胞的筛选与建株参照文献[6]的方法采用间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞的筛选，阳性克隆采用有限稀释法亚克隆3～5次，筛选出能稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞作为建株细胞。

1.4.4 制备腹水8～10 周龄BALB/c雌性小鼠腹腔注射无菌液体石蜡油，每只0.5 mL，7 d 后，腹腔注射杂交瘤细胞，每只50万个。每天观察小鼠腹部，待明显膨大时抽取腹水，离心取上清备用。

1.5 单克隆抗体生物学特性的鉴定

1.5.1 特异性测定以H9N2禽流感病毒、禽传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、禽腺病毒、传染性法氏囊病毒及SPF鸡胚尿囊液包被96 孔酶标板，间接ELISA 鉴定各株单抗反应特异性。

1.5.2 ELISA效价测定以纯化的病毒包被酶标板，加入单抗腹水，倍比稀释，间接ELISA方法检测。

1.5.3 单抗的血凝抑制特性血凝抑制试验按常规方法进行。首先以D58为HI抗原， 鉴定单抗的HI特性。对于有HI特性的单抗， 再分别以不同NDV毒株为HI抗原， 进行检测。

1.5.4 单抗中和活性测定采用细胞中和试验鉴定单抗中和活性，单抗无菌处理后用PBS缓冲液（pH=7.4）1∶10 稀释，再与等体积的200 TCID50病毒液混合，37℃作用1 h，接种80%～90%满的DF1细胞，37℃培养72 h后取细胞培养液测定HA效价，以HA≥2log2判为感染。

1.5.5 单抗亚型鉴定参照试剂盒说明书用单克隆抗体分型试剂盒对试验得到的杂交瘤细胞进行亚型鉴定。

2 结果与分析

2.1 病毒的增殖和纯化

D58接种鸡胚后收集24～20 h鸡胚尿囊液，HA效价为9log2～10log2，病毒经纯化后HA效价为14log2～17log2。

2.2 杂交瘤细胞系的建立

以纯化的D58病毒作为免疫原，经融合和间接ELISA 筛选，共筛选出4株能稳定分泌特异性抗NDV单抗的杂交瘤细胞，并分别命名为杂交瘤细胞3F3、2F10、3G8、3C9。

2.3 单抗特性鉴定

2.3.1 特异性4株单抗与SPF鸡胚尿囊液、禽流感病毒、禽传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、禽腺病毒、传染性法氏囊病毒均不反应，具有良好的特异性。

2.3.2 ELISA效价单抗2F10的ELISA效价为8.00×104，3F3、3G8、3G9的则分别为6.40×104、3.20×104、1.28×104 （表1）。

2.3.3 单抗血凝抑制性经检测单抗2F10 有血凝抑制性，单抗3F3、3G8、3G9无血凝抑制性（表1）。2F10与目前流行的基因2型、基因3型及基因10型ClassⅠNDV毒株的血凝抑制活性为阳性，与基因Ⅰ型、基因Ⅱ型、基因Ⅵ型、基因Ⅶ型及基因Ⅸ型ClassⅡNDV毒株的血凝抑制活性为阴性（表2）。

2.3.4 单抗中和性单抗2F10具有中和性（表1），与37株NDV毒株的中和试验中，2F10与D58等ClassⅠ毒株的中和反应为阳性，与ClassⅡNDV毒株的中和反应为阴性（表2），这与血凝抑制活性结果相同。

2.3.5 单抗亚型鉴定结果通过亚型鉴定发现，2F10与其它三株单抗均属于IgG1亚型，轻链均为κ链。

3 讨论与结论

单克隆抗体常用于NDV抗原差异性的研究。曹殿军等[7]筛选的4株单克隆抗体与黑龙江地区分离的NDV强毒株有特异性反应，而且能区分Lasota和V4弱毒株。孙英杰等[8]制备了ClassⅠ强毒株9a5b的单克隆抗体，其中2株具有IFA和HI效价，且呈现ClassⅠ毒株特异性。Meulemans等[9]將两种单抗混合进行HI试验，发现它们能够抑制所有NDV被检毒株。Alexander等[10]应用一株单抗在HI试验中能够抑制多数NDV分离株，但不能抑制鸽NDV。目前ClassⅠNDV在禽群中的广泛存在给NDV强弱毒的鉴别诊断带来一定的困扰。本研究获得了4株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞并制备了单抗，其中2F10具有中和活性和血凝抑制活性，表明该单抗具有针对NDV HN 蛋白的抗原表位。该单抗只与ClassⅠNDV反应，与ClassⅡNDV不反应，与其它单克隆抗体配合使用可用于NDV强弱毒的鉴别诊断和不同毒株的抗原差异性研究。

参 考 文 献：

[1]De Leeuw O， Peeters B. Complete nucleotide sequence of New-castle disease virus： evidence for the existence of a new genus within the subfamily Paramyxovirinae[J]. Journal of General Virology， 1999， 80（1）： 131-136.

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[5]吴艳涛， 倪雪霞， 万洪全， 等.我国部分地区不同动物来源新城疫病毒的分子流行病学研究[ J]. 病毒学报， 2002 ， 18（3）：264-269.

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[7]曹殿军， 卢景良， 王莉林， 等. 应用单克隆抗体鉴别新城疫病毒强、弱毒株的研究[J]. 中国畜禽传染病， 1996（5）：36-38.

[8]孙英杰， 陈鸿军， 宋翠萍， 等. 新城疫病毒ClassⅠ强毒株HN单克隆抗体的研制及免疫学反应[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2010， 26（5）：464-466.

[9]Meulemans G C， Letellier C， Gonze M， et al. NDVF glycolprotein expressed from a recombinant vaccine virus vector protects chickens against live-virus-challenge[J]. Avian Dis.， 1988， 17（4）： 821-827.

[10]Alexander D J， Manvell R J， Kemp P A， et al.Use of monoclonal antibodies in the characterization of avian paramyxovirus type 1 （Newcastle disease virus） isolates submitted to an international reference laboratory[J]. Avian Pathology， 1987， 16（4）： 553-565.

收稿日期：2019-06-13

基金項目：现代农业产业技术体系建设专项（CARS-42-Z12）

作者简介：杨少华（1978—），女，山东烟台人，硕士，助理研究员，主要从事禽病综合防控技术研究。E-mail： ysh7865@163.com

通讯作者：许传田（1973—），男，博士，研究员，主要从事禽禽病综合防控技术研究。E-mail： xcttaian2002@163.com