siGLUL经Akt/ERK信号通路抑制结肠癌细胞增殖及侵袭

吴 婧,唐晓婷,黄阿妹,房太勇

(福建医科大学附属第二医院消化内科,福建 泉州 362000)

谷氨酰胺连接酶(Glutamate-ammonia ligase,GLUL)又称谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)是在大多数物种中发现的一种ATP依赖性酶，能将谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，用于保持谷氨酸-谷氨酰胺循环以及氮代谢。GLUL是以ATP依赖性反应催化从谷氨酸和氨合成谷氨酰胺的酶。该蛋白质在氨和谷氨酸解毒、酸-碱稳态、细胞信号传导和细胞增殖中起作用。GLUL的表达与肝、肠上皮、视网膜和乳腺等细胞增殖相关。GLUL在肝细胞癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌中上调，可能是一种新的诊断标志物。但该基因在结肠癌中的生物学作用目前尚未报道，尤其与Akt及ERK增殖及侵袭相关信号通路作用不明确。因此，本研究拟探索GLUL如何通过调节Akt/ERK信号途径来促进结肠癌的发生发展。

1 对象及方法

1.1对象 结肠癌细胞SW480购于中国科学院上海细胞库，在37 ℃和5 %的CO2培养条件下含，培养于10 %的DMEM培养基中培养，培养箱中每隔2～3 d传代1次；设计针对GLUL基因的靶向干扰质粒，真核表达质粒pGenesil-1购于上海禾午生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1RT-PCR技术检测GLUL基因转录水平 分别收获对数期生长的SW480细胞、SW480-siGLUL细胞，取5×107个细胞加入1.5 mL离心管中，用枪头吹吸含有1 mL的Trizol液至混匀，室温放置5 min；每管中再加入0.2 mL氯仿，充分颠倒混匀，12 000 g转速4 ℃ 离心5 min；每管再加入1 μL的RNase H，37 ℃反应20 min。GLUL基因引物上游序列5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3',下游序列5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3'；β-actin引物上游序列5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3',下游序列5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'。

1.2.2Western Blot检测GLUL基因翻译水平 分别收获对数期生长的SW480细胞、SW480-siGLUL细胞，100 μL细胞裂解液加入106个细胞溶液，裂解20 min；12 000 g于4 ℃离心5 min；将上清移至离心管中，-70 ℃保存；蛋白浓度用Bradford法检测，每组细胞取30 μg蛋白加入缓冲液混匀，沸水处理5 min，加入蛋白电泳槽；分别加入抗人GLUL单克隆抗体、抗鼠β-actin单克隆抗体，摇动孵育过夜，将抗体抗原充分融合，HRP标记羊抗兔IgG二抗稀释于5 %脱脂牛奶中，缓慢摇动室温孵育2 h，PBS漂洗10 min，共3次，ECL化学发光法显色，观测结果。

1.2.3MTT法检测细胞生长曲线 将对照组SW480-Pu6和实验组siGLUL-SW480细胞扩增充分后消化处理，接种于96孔板，细胞计数，接种后培养24 h，48 h，72 h行MTT检测，将5 mg/mL的MTT试剂以每孔20 μL加入待测96孔板内，37 ℃培养4 h，注射器缓慢吸取上清液，并弃用，每孔加200 μL的DMSO摇床充分振荡10 min，490 nm波长紫外分光光度计测定吸光度。

1.2.4细胞划痕实验检测细胞迁移能力 将对照组SW480-Pu6和实验组siGLUL-SW480细胞分别接种于六孔板中，等其细胞贴壁生长至95 %时，用同一枪头分别划痕，于划痕后的0～24 h在显微镜下动态拍照，比较两组细胞的迁移数量。

1.2.5裸鼠皮下移植瘤实验 将4～6个月大小相近的雄性裸鼠16只随机分成两组，实验组将siGLUL稳转SW480细胞注射裸鼠皮下；对照组用同样方法将转染空载体的SW480细胞注射裸鼠皮下。饲养裸鼠至瘤体肉眼可观测到。用游标卡尺每隔4 d测量瘤体长径、短径，瘤体体积=[length(mm)×width(mm)2]/2，比较两组裸鼠瘤体的生长情况。

2 结果

2.1GLUL在结肠癌细胞SW480中干扰效率 利用RT-PCR和Western Blot检测构建稳定GLUL的SW480细胞系干扰效率，结果显示SW480-siGLUL细胞株1/2均有明显干扰效果，其中siGLUL-1干扰效率最优，以SW480-siGLUL-1细胞株进行后续研究，如图1。

图1 GLUL基因沉默的稳转细胞株在RNA和蛋白水平的验证

2.2GLUL基因沉默抑制肝癌细胞的增殖、迁移功能 利用MTT法检测实验组SW480-siGLUL细胞和对照组SW480-Pu6细胞增长情况。结果显示24 h，48 h，72 h，与对照组比较，siGLUL转染SW480实验组细胞增殖明显减少(t24h=9.238,t48h=11.379,t72h=8.213，P<0.05)，如图1-A；细胞划痕试验显示实验组siGLUL转染SW480细胞迁移数量较对照组减低(t=7.921;P<0.05)，如图1-B。

2.3SGLUL抑制AKT及ERK介导的细胞信号途径 Western Blot检测实验组SW480-siGLUL细胞AKT的磷酸化水平明显下降，如图2，活性减弱；ERK1/2的磷酸化水平明显下降，活性增强(ERK1/2的活性形式为去磷酸化)，如图2。

图2 GLUL基因表达沉默对AKT-和ERK-细胞信号通路的影响

2.4GLUL基因沉默抑制裸鼠皮下移植瘤的生长 实验组SW480-siGLUL细胞及对照组SW480-Pu6细胞分别注射裸鼠皮下，诱导裸鼠皮下移植瘤产生(图2-A)；与对照组相比，4 d、7 d、10 d、13 d及16 d实验组移植siGLUL-SW480细胞裸鼠瘤体体积明显减小(P<0.01)，如图2-B。

3 讨论

结肠癌是常见消化道肿瘤之一，但多数患者诊断时已属晚期，且化疗中易出现耐药，导致结肠癌预后较差。因此，阐明结肠癌演进生物学机制并寻找有效诊治靶点迫在眉睫。谷氨酰胺在肿瘤生长中扮演重要角色。但是，与葡萄糖代谢在肿瘤中的意义相比，谷氨酰胺代谢在肿瘤中的作用了解甚少。因此，本研究探讨谷氨酰胺合成代谢关键酶(Glutamate-ammonia ligase,GLUL)对结肠癌发生发展中的作用机制。本研究观察GLUL基因表达沉默后对SW480细胞功能的影响，MTT及细胞划痕试验显示干扰GLUL可抑制细胞增殖和迁移，证实GLUL对SW480细胞增殖和迁移具有促进作用。进一步动物体内实验显示GLUL对肿瘤形成的重要作用，与对照组相比，GLUL干扰后裸鼠皮下瘤的生长速度和瘤体大小均减少。由此可见，GLUL在结肠癌发展中扮演重要角色。关于GLUL介导结肠癌发展的具体机制需要进一步研究。

在诸多信号传导途径中AKT及ERK通路处于核心地位，在胃癌、结直肠癌、前列腺癌和卵巢癌的发生发展中发挥重要功能。AKT及ERK信号通路可以激活下游信号分子，也可与其它信号分子相互影响并引起级联活化效应。因此，AKT及ERK信号在诸多信号传导途径中处于核心地位。那么，在结肠癌中GLUL是否也是介导AKT及ERK信号通路影响细胞增殖及侵袭等生物学表型目前仍不清楚。本研究显示GLUL基因沉默的SW480细胞，p-AKT和p-ERK的表达也随之下调，即AKT、ERK的活性均下降，因此初步认为GLUL也是通过AKT/ERK途径来影响结肠癌生长。

综上所述，GLUL促进SW480细胞的生长、增殖和迁移，从而促进人类结肠癌的发展过程，这一过程是通过影响Akt和ERK细胞信号转导途径来实现的。GLUL是谷氨酰胺合成的关键酶，后者是肿瘤细胞除Warburg效应外获取能量来源的重要途径，也是细胞内氮源重要的供体。GLUL有望成为结肠癌基因治疗生物靶点。