UPLC法测定牛黄上清丸中连翘酯苷A的含量

庞 静，王晓云，王 健，韩 笑

（秦皇岛市食品药品检验中心，河北 秦皇岛 066000）

牛黄上清丸为甲类OTC，1977～2015年版《中国药典》均有收载，处方来源于明代李梃《医学入门》牛黄上清丸加减方，由人工牛黄、薄荷、菊花、荆芥穗、白芷、川芎、栀子、黄连、黄柏、黄芩、大黄、连翘、赤芍、当归、地黄、桔梗、甘草、石膏、冰片十九味药组成，具有清热泻火，散风止痛的功效。用于热毒内盛、风火上攻所致的头痛眩晕、目赤耳鸣、咽喉肿痛、口舌生疮、牙龈肿痛、大便燥结[1-2]。

牛黄上清丸处方中的连翘，性苦，微寒，具清热解毒、消肿散结、疏散风热的功效。现行的牛黄上清丸质量标准[1]仅对连翘进行了显微鉴别和利用高效液相色谱法（HPLC）测定连翘酯苷A保留时间进行鉴别，而无含量测定方法。经查阅文献，连翘化学成分包括苯乙醇苷类、木脂素及其苷类、黄酮类、五环三萜类、挥发油类等[3-4]，其中连翘酯苷A含量明显高于其他成分[5-6]，且提取方法简单、易操作。在参考已有文献的基础上，本文选择连翘酯苷A作为质控的指标性成分。连翘酯苷A的检测方法多为HPLC[7-11]，测定过程较为耗时。本研究建立了超高效液相色谱（UPLC）快速测定牛黄上清丸中连翘酯苷A含量的方法，为牛黄上清丸的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ACQUITY UPLC®H-Class型超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；AG-135型电子天平（美国Mettler Toledo公司）；DL-1028H型超声波清洗器（德国Bandelin公司）。

1.2 试药

连翘酯苷A对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111810-201415，含量94.1 %）；牛黄上清丸样品（均为大蜜丸）由9个药厂提供；甲醇、乙腈（美国MREDA，色谱纯），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取连翘酯苷A对照品14.82 mg，置入25 ml量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.5578 mg/ml的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 取本品约1 g，剪碎，精密称定，置入具塞锥形瓶，精密加入70 %甲醇50 ml，称定重量，超声处理（功率600 W，频率35 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用70 %甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性对照溶液制备 取处方中除去连翘以外的18味中药材适量，按处方比例及制备工艺同法制成大蜜丸，并按2.1.2项下方法制备阴性对照溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：ACQUITY UPLC®BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈-0.05 %磷酸溶液（15:85）；流速为0.4 ml/min；检测波长330 nm；柱温为30 ℃；进样量为1 μl。在此条件下，连翘酯苷A峰的理论塔板数大于8000，与其他成分分离度良好，且阴性样品无干扰，见图1。

图1 牛黄上清丸中连翘酯苷A含量测定UPLC色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密量取对照品溶液0.20，0.75，1.5，3.5，5.0 ml，分别置入25 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得不同浓度系列的对照品溶液。按2.2项下色谱条件分别进样，测定峰面积，以浓度（μg/ml）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=4 283 994.374X-17 312.540，r=0.9999（n=6）。结果表明，连翘酯苷A浓度在4.462～111.560 μg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.3.2 精密度 取2.1.1项下对照品溶液，精密量取3.5 ml，置入25 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按2.2项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，结果峰面积RSD为0.70 %，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取同一均匀样品（批号15015669），平行取样6份，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件分别进样测定。结果连翘酯苷A平均含量为1.0886 mg/g，RSD为0.93 %，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性考察 取同一供试品溶液，分别于配置后在室温下放置0，4，8，12，16，20，24 h进样测定，记录峰面积，结果连翘酯苷A峰面积RSD为1.08 %，表明供试品溶液在室温下24 h内稳定。

2.3.5 加样回收率测定 取已知含量（批号15015669，含量：1.0886 mg/g）的样品9份，每份约0.5 g，精密称定，置入具塞锥形瓶，分别精密加入2.1.1项下连翘酯苷A对照品溶液（0.5578 mg/ml）0.5，1.0，1.5 ml，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样测定，测得连翘酯苷A的平均加样回收率为100.08 %，RSD为0.87 %（n=9），见表1。

表1 连翘酯苷A加样回收率测定结果

2.4 样品测定

取9个不同厂家的9批次的牛黄上清丸，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，并按2.2项下色谱条件测定含量，测定结果见表2。

表2 连翘酯苷A含量测定结果

3 讨论

3.1 提取方法的选择

通过查阅文献[8-14]，选择了纯甲醇、70 %甲醇、30 %甲醇、水分别为提取溶剂进行提取，结果以70 %甲醇提取的含量最高。在提取方式上，对超声处理30 min、加热回流1 h及超声处理30 min之后再加热回流1 h 3种方式进行比较，结果3种方式得到的连翘酯苷A含量差异不大。所以最终确定提取方法为以70 %甲醇为溶剂，超声处理30 min。

3.2 流动相的选择

本试验比较了乙腈-0.4 %冰醋酸溶液（15:85）、乙腈-0.05 %磷酸溶液（15:85）系统的分离效果，结果以乙腈-0.05 %磷酸溶液（15:85）为流动相时，连翘酯苷A峰形良好且阴性无干扰。