冬凌草甲素抑制胃癌细胞增殖及增强西妥昔单抗化疗敏感性的机制研究

白江江, 宗新玲, 高维东, 曹光材, 霍爱鑫

(延安大学附属医院, 1. 肛肠外科; 2. 免疫风湿科, 陕西 延安, 716000)

中国胃癌每年新发病例约占世界年发病例数的40.00%, 胃癌发病率和死亡率逐年上升，约60.00%的胃癌患者首次就诊时已处于进展期[1-2], 而传统的化疗药物对进展期胃癌的治疗效果仍不理想。近年来，针对关键分子的靶向治疗逐渐应用于进展期胃癌的治疗[3-4], 但原发或继发耐药现象导致部分胃癌患者的治疗效果欠佳，研究胃癌的分子靶向药物的耐药调控机制，可能为胃癌的精准治疗提供新的研究方向[5]。本研究通过冬凌草甲素、西妥昔单抗单药或联合与SGC7901胃癌细胞株共培养后，检测冬凌草甲素对SGC7901胃癌细胞株增殖、凋亡的影响，探讨冬凌草甲素增强西妥昔单抗化疗敏感性的机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞系、试剂与仪器

人胃癌细胞系SGC7901购于中国科学院上海细胞库。RPMI- 1640细胞培养基(美国Hyclone 公司); 四甲基偶氮唑蓝(美国Promega); 荧光实时定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司); 冬凌草甲素(碧云天生物技术有限公司); Western Blot检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司); 流式细胞仪(BD Biosciences公司); 实时荧光定量PCR仪(美国Bio Rad公司); SDS- PAGE 蛋白电泳槽(美国Bio- Rad公司)。

目的基因引物序列如下: 人B细胞淋巴瘤- xL(Bcl- xL)的正向引物序列(5′- 3′)TCGAGGCCTATGTAACG, 反向引物序列(5′- 3′)ACCGTCGGTAAGCTGAG; 细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的正向(5′- 3′)CGTGTTACCAGATA, 反向(5′- 3′)ATCGTCTAGGACCTGTACC; β激动蛋白(β- actin)的正向(5′- 3′)CGAGTCAGGGCTAATGC, 反向(5′- 3′)ACGTGTTGGCAAGCTACC。

1.2 实验方法

1.2.1 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测冬凌草甲素对胃癌细胞SGC7901的增殖抑制: 人胃癌SGC7901细胞系均置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养。培养液为含10%胎牛血清的RPMI1640, 取对数生长期细胞，待细胞铺满瓶底面积80%～90%时用0.25%胰酶终止培养，按5 000/孔接种于96孔板，加入冬凌草甲素使终浓度分别为10.00、20.00、40.00、80.00 μmol/L, 共培养48 h; 将5.00 mg/mL MTT溶液20.00 μL加入到细胞培养孔中，继续培养箱孵育4 h; 弃上清液，每孔加入150.00 μL 二甲基亚砜(DMSO), 振荡5 min, 在酶标仪上测吸光度(OD)值，计算细胞抑制率。另取5组细胞，加入冬凌草甲素使其终浓度40.00 μmol/L, 共培养0、24、48、72 h，同样方法计算细胞抑制率。

1.2.2 冬凌草甲素、西妥昔单抗单药、联合用药对SGC7901胃癌细胞凋亡的影响: 取对数生长期胃癌细胞SGC7901, 将细胞分为4组，即空白对照组; 冬凌草甲素组，终浓度40.00 mol/L; 西妥昔单抗组，终浓度0.05 g/L; 冬凌草甲素(40.00 mol/L)联合西妥昔单抗(0.05 g/L)用药组。每组设5个复孔，共培养24 h后MTT法计算细胞抑制率。取上述4组细胞，培养24 h后, PBS洗涤3次，制备单细胞悬液, 100.00 μL的单细胞悬液中，加入5.00 μL Annexin V- FITC和2.50 μL PI, 避光孵育15 min, 加入结合缓冲液后上流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率及各细胞周期细胞数。

1.2.3 细胞中表皮生长因子受体(EGFR)、蛋白激酶B(AKT)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)磷酸化表达水平以及Bcl- xL、Cyclin D1的转录水平: 取对数生长期胃癌细胞SGC7901, 将细胞分为4组，即空白对照组; 冬凌草甲素组，终浓度40.00 mol/L; 西妥昔单抗组，终浓度0.05 g/L; 冬凌草甲素(40.00 mol/L)联合西妥昔单抗(0.05 g/L)用药组; Trizol法提取细胞内总RNA, RT- PCR检测细胞内Bcl- xL、Cyclin D1 mRNA的表达。另取上述4组细胞, RIP法裂解细胞; 提取细胞总蛋白，经SDS- PAGE电泳分离、转膜、抗体结合、显色后检测磷酸化表皮生长因子受体(pEGFR)、磷酸化蛋白激酶B(pAKT)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(pERK)、磷酸化信号传导及转录激活蛋白3(pSTAT3)蛋白的表达。

2 结 果

2.1 冬凌草甲素对胃癌细胞SGC7901的增殖抑制

胃癌细胞SGC7901与不同浓度冬凌草甲素共培养48 h后，冬凌草甲素浓度越高，对胃癌细胞的增殖抑制作用越强, 80.00 μmol/L的冬凌草甲素的细胞抑制率达(83.60±10.80)%, 高于10.00、20.00、40.00 μmol/L冬凌草甲素的细胞抑制率(F=67.78,P<0.01)。40.00 μmol/L的冬凌草甲素浓度与SGC7901共培养不同时间后，随着作用时间的延长，其对胃癌细胞的抑制也逐渐增强, 72 h细胞抑制率为(95.60±21.40)%, 高于其他时点，差异有统计学意义(F=41.78,P<0.01)。见图1。

A: 不同质量浓度的冬凌草甲素对胃癌细胞的抑制率; B: 40 μmol/L冬凌草甲素不同作用时间下对胃癌细胞的抑制率

图1 冬凌草甲素对胃癌细胞SGC7901增殖的抑制作用

2.2 冬凌草甲素、西妥昔单抗单药及联合用药对SGC7901胃癌细胞增殖、凋亡的影响

MTT检测冬凌草甲素、西妥昔单抗单药、联合用药与SGC7901胃癌细胞共培养后，联合用药组对细胞的抑制率为(86.40±11.60)%, 显著高于单药处理组(F=77.46,P<0.01)。见图2。流式细胞仪检测冬凌草甲素联合西妥昔单抗处理组细胞凋亡率高达(57.10±8.70)%, 显著高于西妥昔单抗组(9.30±2.20)%、冬凌草甲素组(18.20±4.20)%、对照组(2.90±0.90)%, 且冬凌草甲素组高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。冬凌草甲素作用细胞后G0/G1期细胞比例为(48.60±7.30)%, 西妥昔单抗作用后G0/G1期细胞比例为(45.80±6.70)%, 联合用药组G0/G1期细胞增加至(70.30±8.50)%, S期细胞减少至(15.10±2.60)%, 与其他各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.3 细胞中EGFR、AKT、ERK、STAT3磷酸化表达水平以及Bcl- xL、Cyclin D1的转录水平

以SGC7901胃癌细胞株为实验对象，采用 Western blot 法检测pEGFR、pAKT、pERK、pSTAT3表达变化，结果显示，冬凌草甲素处理细胞后pEGFR、pAKT、pERK、pSTAT3表达下降，冬凌草甲素联合西妥昔单抗联合用药组细胞下降更明显，与其余各组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。Real- time PCR检测细胞内Bcl- xL、Cyclin D1 mRNA的表达变化，结果显示冬凌草甲素处理细胞后, Bcl- xL、Cyclin D1表达下降，冬凌草甲素联合西妥昔单抗联合用药组细胞下降更明显，与其余各组比较均有显著差异(P<0.05)。见图4。

图2 冬凌草甲素、西妥昔单抗单药、联合用药对SGC7901胃癌细胞增殖的影响

图3 冬凌草甲素、西妥昔单抗单药、联合用药对SGC7901细胞周期的影响

A: 不同组别中pEGFR、pAKT、pERK、pSTAT3的蛋白相对表达; B: Real- time PCR检测不同组别中Bcl- xL、Cyclin D1的mRNA表达

图4 冬凌草甲素、西妥昔单抗单药、联合用药对pEGFR、pAKT、pERK、pSTAT3、Bcl- xL、Cyclin D1表达的影响

3 讨 论

中国胃癌的发病率居恶性肿瘤第2位，进展期胃癌的病死率较高，以外科手术切除为主的治疗方案是进展期胃癌的主要治疗手段，但发生转移时的胃癌患者5年存活率仅为2.00%。多项研究[6-7]证实, EGFR在胃癌中呈高表达，并与肿瘤侵袭、转移及不良预后有关。近年来，针对EGFR的靶向药物西妥昔单抗联合常规化疗药已用于晚期胃癌患者的治疗，然而疗效欠佳[8-9]。研究[10-12]发现，西妥昔单抗的原发耐药及获得性耐药可能是导致其疗效不显著的主要原因。

冬凌草甲素是一种从冬凌草植物提取的二萜类化合物，具有抗肿瘤等多种生物活性，对人表皮癌A431细胞、宫颈癌Hela细胞、人前列腺PC- 3癌细胞具有抑制增殖、诱导凋亡的作用[13]。胃癌组织中过表达的EGFR能通过磷酸化上调下游信号通路ERK、AKT/NFκB和 JNK- STAT3, 从而增强肿瘤细胞增殖、侵袭能力[14-15]。本研究发现，冬凌草甲素抑制胃癌细胞的增殖呈浓度与时间依赖性，浓度越高，作用时间越长，抑制细胞增殖作用越明显。冬凌草甲素联合西妥昔单抗用药对细胞的抑制率(86.40±11.60) %,高于冬凌草甲素、西妥昔单抗单药处理，表明冬凌草甲素联合西妥昔单抗能有效增强其抑制细胞的增殖作用。冬凌草甲素联合西妥昔单抗诱导细胞凋亡较单药明显，初步证实冬凌草甲素可抑制胃癌细胞增殖及增强西妥昔单抗化疗敏感性。

人类信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)基因定位于第17号染色体(q21.31)[16], 研究[17]证实胃癌中酪氨酸激酶异常激活将导致STAT3磷酸化，磷酸化的STAT3转移至细胞核内，调控下游靶基因Cyclin D1、Bcl- xL, 促进肿瘤细胞凋亡。目前, EGFR抑制剂西妥昔单抗并未显示出显著的抗癌疗效，但本研究发现，冬凌草甲素联合西妥昔单抗处理组细胞凋亡率高达(57.10±8.70)%, G0/G1期细胞比例增至(70.30±8.50)%, S期细胞比例降低至(15.10±2.60)%, 与单独用药比较均有显著差异，表明冬凌草甲素不但能增强西妥昔单抗诱导凋亡能力，还能阻滞人胃癌细胞SGC7901于G0/G1期，从而使肿瘤细胞对常规细胞周期毒性化疗药物敏感性增加。