五没食子酰基葡萄糖对H2O2诱导的肾小球系膜细胞氧化损伤及凋亡的影响

林爱琴，卜文婕，窦德宇2，宫磊

(1. 皖南医学院医学生物学教研室，安徽 芜湖 241002； 2. 活性生物大分子研究安徽省重点实验室，安徽 芜湖 241002)

五没食子酰基葡萄糖(英文全称Penta-O-galloyal-D-glucose，简称PGG)广泛存在于自然界的植物中，其中五倍子中的含量最高，其次为牡丹皮、白芍、赤芍、黄芩等[1]。由于PGG分子中含有多个酚羟基[2]，从而它具有了独特的理化性质和生理活性，表明 PGG 将可能成为一种天然抗氧化剂而具有潜在的广泛应用前景。正常情况下，机体不断产生活性氧(ROS)、超氧阴离子等，同时机体中的超氧化物歧化酶(SOD)、维生素E、谷胱甘肽还原酶等进行抗氧化清除，而剩余的ROS参与维持血管紧张和一系列信号传导过程，当机体在外部刺激下，ROS增多，氧化程度超过了抗氧化清除能力，机体出现了氧化应激(OS)[3]。本研究通过一定浓度的过氧化氢(H2O2)刺激大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)产生氧化应激，了解不同浓度的PGG对GMCs细胞抗氧化能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株 GMCs细胞株来源于皖南医学院弋矶山医院中心实验室。

1.1.2 实验试剂 PGG，上海源叶生物科技有限公司；30%H2O2，国药集团化学试剂有限公司；低糖DMEM培养基，美国Hyclone公司；胎牛血清，澳洲CLARK Bioscience公司；CCK8试剂盒，碧云天生物技术有限公司；活性氧检测试剂盒，碧云天生物技术有限公司；细胞凋亡试剂盒，碧云天生物技术有限公司；总SOD活性检测试剂盒，碧云天生物技术有限公司；总谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒，碧云天生物技术有限公司。

1.1.3 主要的实验仪器设备 多功能微孔检测仪(瑞士TECAN，M200 PRO)，流式细胞仪(BD公司，FACSVerseTM)，超净工作台(苏州苏净，SW-CJ-2FD)，高速离心机(美国Eppendorf)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将细胞株从液氮罐中取出迅速在37℃水浴锅中水浴，复苏后接种于完全培养基(含有10%胎牛血清的低糖DMEM培养基)中。在5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养，待细胞生长至80%时进行消化传代，本实验选取5～7代对数生长期细胞进行研究。

1.2.2 H2O2和PGG最佳浓度的筛选 用完全培养基将GMCs细胞稀释成单个细胞悬液并接种于96孔板中，24 h细胞贴壁后，换用无血清的低糖DMEM培养基饥饿12 h，用无血清低糖DMEM培养基配制不同浓度H2O2(100 μM、200 μM、300 μM、400 μM、500 μM、600 μM)，PGG用DMSO溶解后用无血清低糖DMEM培养基稀释成不同浓度(0.1 μM、1 μM、5 μM、10 μM、20 μM)，CCK8试剂盒检测分别筛选出最佳浓度的H2O2(对细胞产生一定损伤的浓度)和PGG(对细胞不产生毒性的浓度)。

1.2.3 流式细胞术检测各组ROS和细胞凋亡水平 取对数生长期细胞均匀接种于6孔板上，分为6组：正常组、阳性组、10 μM PGG组、5 μM PGG组、1 μM PGG组、0.1 μM PGG组，每组3个复孔，待贴壁后换无血清培养基饥饿3 h各组进行加药处理，正常组为不做处理的GMCs细胞，阳性组细胞给予600 μM的H2O2刺激，PGG各组细胞给予600 μM的H2O2和不同浓度PGG刺激，各组在处理18 h后，通过流式细胞仪上机检测，采用Flowjo 7.6软件对结果进行分析，计算ROS和凋亡水平。

1.2.4 试剂盒检测各组SOD和GSH-Px水平 各组细胞按上述方法在6孔板中处理后，分别加入裂解液，蛋白裂解后制成样品，用试剂盒检测每个样品中SOD和GSH-Px含量，再检测样品的蛋白含量，最终结果以单位总蛋白中的目的蛋白的含量为准。

2 结果

2.1 H2O2和PGG最佳浓度的筛选 当H2O2浓度达到500 μM时，OD值与正常组开始产生显著差异(P<0.05)，在600 μM浓度下，与正常组间差异更明显(P<0.01)，因此，600 μM的H2O2可作为较合适的浓度，刺激细胞产生氧化作用。见表1。PGG浓度在达到20 μM时，其OD值明显低于正常组(P<0.01)，说明此浓度对GMCs细胞产生了一定毒性，细胞发生凋亡，所以本实验选择PGG的最高浓度为10 μM。见表2。

表1 不同浓度H2O2对GMCs细胞产生的影响

注：与正常对照组比较，a：P<0.05，b：P<0.01

表2 不同浓度PGG对GMCs细胞产生的毒性影响

注：与正常对照组比较，a：P<0.01

2.2 不同浓度PGG对H2O2诱导GMCs细胞中ROS含量的影响 流式细胞仪检测结果(见图1)显示，随着PGG浓度的升高，GMCs细胞产生的ROS逐渐减少，0.1 μM PGG组虽然减少但与阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。从1 μM PGG浓度开始，PGG各组与阳性对照组的ROS含量有明显差异(P<0.05)，其中10 μM PGG组与正常组间已无差异，表明在一定浓度范围内PGG的抗氧化作用随着浓度的升高而增强。

图1 不同浓度PGG对H2O2诱导的GMCs细胞产生ROS的影响

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与阳性组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

2.3 不同浓度PGG对H2O2诱导GMCs细胞凋亡的影响 氧化应激可引起GMCs细胞产生细胞凋亡，本实验结果显示(见图2)，在600 μM H2O2的浓度下，细胞凋亡最多，达到38.76%，当加入PGG保护时，随着PGG浓度升高，细胞凋亡率逐渐减少，但仍存在一定凋亡，与阳性组相比，有显著降低(P<0.05)。

图2 不同浓度PGG对H2O2诱导的GMCs细胞凋亡的影响

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与阳性组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

2.4 不同浓度PGG对H2O2诱导的GMCs细胞SOD、GSH-Px活力的影响 10 μM、5 μM和1 μM PGG组的SOD水平均明显高于阳性组，10 μM PGG组的SOD活性较其他加药组最高，与正常组间差异无统计学意义(P>0.05)，0.1 μM PGG组则与阳性组间差异无统计学意义(P>0.05)。PGG组细胞的GSH-Px水平均明显高于阳性组，但低于正常组，差异有统计学意义(P<0.5)，随着PGG浓度的升高，GSH-Px活力水平也相应增加。见表3。

表3 不同浓度PGG对H2O2诱导的GMCs细胞产生氧化应激的相关因子活性

注：与正常组比较，a：P<0.05，b：P<0.01，c：P<0.001；与阳性组比较，d：P<0.05，e：P<0.01，f：P<0.001

3 讨论

糖尿病肾病作为糖尿病主要慢性并发症之一，近年来临床及实验研究表明其发病机制与很多因素有关，主要包括氧化应激、蛋白激酶C、蛋白非酶糖基、多元醇通路4种学说，其中氧化应激在其发展中起到关键作用[4-5]。氧化应激指的是机体遭受到各种刺激后，体内的ROS产生过多，引起氧化系统和抗氧化系统的失衡，细胞产生脂质过氧化，导致溶酶体和线粒体损伤，进而导致组织损伤的一系列过程[6]。ROS作为机体代谢过程中氧化还原反应产物，参与调节杀菌、解毒等多种代谢途径[7],也是细胞凋亡的前期产物。而过量的ROS是引起糖尿病肾损伤多条通路激活的共同途径[8]。过氧化氢(H2O2)是一种强氧化剂，能够诱导机体产生大量的ROS，导致机体产生氧化应激反应，从而引起氧化损伤。目前由于H2O2比较容易获得并且其性质相对稳定，易透过细胞膜，从而生成活性氧自由基，因而很多研究都是通过H2O2作为诱导细胞产生氧化应激模型[9-10]。

当细胞内ROS产生和清除的动态平衡被打破时，就会启动有效地抗ROS防御体系，如SOD、GSH-Px等因子[11]。SOD 和 GSH-Px是细胞内重要的抗氧化酶，具有降解细胞内ROS的作用[12]。SOD能够催化ROS生成H2O2和O2，其活性在一定程度上体现了机体对活性氧自由基的清除能力[13]，通过特异地与超氧化物阴离子(O-2) 发生歧化反应，清除O-2，保护机体免受自由基的损害。GSH-Px进一步代谢H2O2，加速H2O2的分解形成分子O2和H2O[14]，阻断氧化反应发挥拮抗脂质过氧化作用，避免H2O2对细胞的影响。

PGG具有多种生物及药理活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗血管再生以及延长寿命等，近年来有研究发现PGG在治疗糖尿病方面具有较高的价值[15]。本实验通过600 μM H2O2刺激GMCs细胞并同时加入不同浓度PGG，检测ROS水平及细胞凋亡程度，并检测细胞中抗氧化相关因子SOD和GSH-Px水平，从而研究不同浓度PGG是否对氧化应激损伤下的GMCs细胞产生一定的抗氧化作用。最终结果表明，随着PGG浓度的升高，GMCs细胞中ROS水平逐渐降低，细胞凋亡程度减轻，当PGG浓度达到10 μM时，与正常组间无显著差异，说明此浓度下的PGG能有效减少H2O2诱导细胞产生的ROS，从而减少细胞凋亡程度；PGG各组的SOD和GSH-Px活性均显著高于阳性组，其中10 μM PGG组表达量最高，说明氧化应激水平明显降低，所以，PGG可能通过影响细胞内SOD和GSH-Px的水平，减少H2O2对GMCs细胞产生的氧化应激，减少ROS产生，进一步减少细胞凋亡，从而对细胞起到一定的保护作用。

综上所述，PGG对于H2O2引起的GMCs细胞产生的氧化应激有一定抗氧化作用，提示PGG可能作为一种抗氧化途径解决糖尿病肾病损伤，为后续PGG在糖尿病肾病方面的研究提供了一定的理论依据和实验基础。