云南省主要小杂粮多酚对亚硝酸盐的清除作用

2019-12-26 06:14陈春华杨士花初雅洁李淳毕晓菲李晴罗恒国李永强
食品研究与开发 2019年1期
关键词:蒸馏水杂粮青稞

陈春华,杨士花,初雅洁,李淳,毕晓菲,李晴,罗恒国,李永强,*

(1.云南农业大学食品科学技术学院,云南昆明650201;2.云南农业大学外语学院,云南昆明650201;3.大理农林职业技术学院,云南大理671003;4.云南永平县综合检验检测院,云南永平672600;5.云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所,云南保山678000)

小杂粮作为云南种植业结构优化的特色作物[1],有着种植面积广、产量高和品种资源丰富等优势,种植面积占全国的6.1%,产量占全国的7%~11.7%[2],在粮食产业开发中具有较大的潜力。云南省主要的小杂粮包括红米、黑米、苦荞、老黑谷米、藜麦、青稞、甜荞、薏仁、燕麦、紫米等[3-4]。小杂粮中不但含有蛋白质等营养物质,而且富含多酚等功能性物质。研究发现,谷物中酚类化合物约90%为酚酸,阿魏酸含量占酚酸的90%以上[5-7]。小杂粮中多酚含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素[8],具有抗氧化、抗菌、抗衰老等作用,能够预防癌症、预防心血管疾病[9-11]。

亚硝酸盐具有发色、抑菌、防腐、增加风味等作用[12-13],是食品工业中一种非常重要的添加剂。但是研究表明,亚硝酸盐可以与二甲胺结合,生成有致癌作用的二甲基亚硝胺,对人类健康具有潜在威胁[14-15]。多酚具有一定的还原性,亚硝酸盐具有一定的氧化性,两者发生氧化还原反应[16],能够阻断亚硝胺合成,进而清除亚硝酸盐。研究发现果蔬、香辛料和茶叶的多酚对亚硝酸盐有一定的清除作用[17-19]。目前,关于小杂粮多酚对亚硝酸盐清除作用研究鲜有报道。本试验在单因素试验的基础上利用响应面优化确定青稞多酚清除亚硝酸盐的最佳工艺条件,基于小杂粮中阿魏酸是主要的多酚化合物,所以在此条件下,比较研究10种小杂粮多酚对亚硝酸盐的清除作用,为小杂粮的开发利用提供科学理论依据,也为小杂粮的精深加工提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫米:墨江县农业局;青稞:迪庆藏族自治州农科所;老黑谷米:云南迪庆州维西县攀天阁乡;藜麦、薏仁、燕麦、红米、黑米、甜荞、苦荞:云南省中储粮储备库。

盐酸萘乙二胺:国药集团化学试剂有限公司;对氨基苯磺酸:天津市光复精细化工研究所;亚硝酸钠:西陇化工股份有限公司;阿魏酸:北京北纳创联生物技术研究院;Folin-Ciocalteau试剂:sigma公司;所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

RE-52AA旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;TDL-5-A离心机:上海安亭科学仪器厂;恒温水浴锅:北京市永光明医疗仪器有限公司;冷冻干燥机:郑州南北仪器设备有限公司;UV-1800CP紫外分光光度计:上海美谱达仪器有限公司;磨粉机:广州雷迈机械设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多酚的提取

参考文献[20]略做改动,小杂粮磨粉后,过50目筛,制得面粉样品,准确称取小杂粮面粉20 g于500 mL的烧杯中,加入75%的乙醇400 mL,超声提取25 min,4 000 r/min离心10 min,取上清液,40℃下减压浓缩后,然后将浓缩液冷冻干燥,得到小杂粮多酚提取物。

1.3.2 多酚含量的测定

参考文献[21-22]略做改动,称取0.05 g的小杂粮多酚提取物于50 mL的离心管中,用乙醇定容至10 mL备用,取小杂粮多酚样液1 mL于50 mL离心管中,加入0.5 mL的Folin-Ciocalteau,再加入1 mL的饱和Na2CO3,定容至10 mL。在避光处反应35 min后,离心10 min,以不加入小杂粮多酚提取液管为空白组,于725 nm测定吸光度,以阿魏酸为标准品建立回归方程为:

式中:y为多酚含量,μmol;x为阿魏酸浓度,μmol/L;结果表示为每g样品所含总多酚相当于阿魏酸的微摩尔数[μmol ferulic acid equivalents(FAE)/g]。

1.3.3 亚硝酸盐清除率的测定

依据GB 5009.33-2016《食品安全国家标食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》进行亚硝酸盐的测定。准确移取0.5 mL 200 μg/mL NaNO2置于50 mL的离心管中,加入一定量的小杂粮多酚提取液,用蒸馏水定容至10 mL后,取2 mL反应液于50 mL容量瓶中,加入2 mL 0.4%对氨基苯磺酸,摇匀静置5 min,然后加入1 mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液,摇匀静置15 min,于538 nm处测定吸光度。按照下式计算清除率:

式中:A1为未加入小杂粮多酚提取液所测得的吸光度;A2为加入小杂粮多酚提取液所测得的吸光度。

1.3.4 单因素试验

1.3.4.1 青稞多酚用量对亚硝酸盐清除作用的影响

准确吸取 0.5、1、1.5、2、2.5 mL 浓度为 25 mmol/mL的青稞多酚提取液于50 mL的离心管中,分别加入0.5 mL的NaNO2(200 μg/mL),用蒸馏水定容至10 mL,在60℃条件下反应30 min,以蒸馏水代替样品作空白。取2 mL反应液,参照1.3.3方法计算亚硝酸盐的清除率。

1.3.4.2 反应温度对亚硝酸盐清除作用的影响

准确吸取1 mL浓度为25 mmol/mL的青稞多酚于50 mL的离心管中,加入0.5 mL的NaNO2(200 μg/mL),用蒸馏水定容至 10 mL,分别在 40、50、60、70、80 ℃下反应30 min,以蒸馏水代替样品作空白。取2 mL反应液,参照1.3.3方法计算亚硝酸盐的清除率。

1.3.4.3 反应时间对亚硝酸盐清除作用的影响

准确吸取1 mL浓度为25 mmol/mL的青稞多酚于50mL的离心管中,加入0.5mL的NaNO2(200μg/mL),用蒸馏水定容至10 mL,在60℃下分别反应10、20、30、40、50 min,以蒸馏水代替样品作空白。取2 mL反应液,参照1.3.3方法计算亚硝酸盐的清除率。

1.3.5 响应面试验设计

在单因素试验结果的基础上,根据中心组合设计(central composite design,CCD)原理[23],选取反应温度(X1)、反应时间(X2)和青稞多酚浓度(X3)3 个因素,设计三因素五水平试验,使用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计和结果方差分析。

1.3.6 小杂粮多酚对亚硝酸盐清除作用的比较研究

准确吸取1.1 mL浓度为25 mmol/mL的10种小杂粮多酚(多酚含量相同,相当于阿魏酸27.5 mmol)于50 mL的离心管中,分别加入0.5 mL的NaNO2(200 μg/mL),用蒸馏水定容至 10 mL,在最佳工艺条件下进行反应,以蒸馏水代替样品作空白。取2 mL反应液,参照1.3.3方法计算亚硝酸盐的清除率。

1.3.7 数据分析

所有样品重复3次,采用SPSS 22.0软件,通过t检验方法进行 ANOVA分析。采用Design-Expert 8.0.6,通过CCD原理进行响应面试验设计。

2 结果与分析

2.1 青稞多酚用量对亚硝酸盐清除作用的影响

青稞多酚用量对亚硝酸盐清除率的影响见图1。

图1 青稞多酚用量对亚硝酸盐清除率的影响Fig.1 The effect of hulless barley polyphenols at different concentrations on nitrite scavenging rate

由图1可知,随着青稞多酚用量的增大,青稞多酚对亚硝酸盐清除率呈增加趋势,但是当多酚用量超过1 mL后,清除作用增加不明显,可能是由于青稞多酚对亚硝酸盐的清除作用达到饱和所致,同时增大用量,会增加成本,所以选择青稞多酚用量1 mL为宜。

2.2 反应温度对亚硝酸盐清除作用的影响

反应温度对亚硝酸盐清除作用的影响见图2。

图2 反应温度对亚硝酸盐清除作用的影响Fig.2 The effect of reaction temperature on nitrite scavenging rate

由图2可知,随着温度的增加,青稞多酚对亚硝酸盐的清除率呈先上升后下降的趋势。在60℃时清除率达到最大值为60.2%,当温度大于60℃时,随温度的升高,青稞多酚对亚硝酸盐的清除作用呈下降趋势,原因可能是多酚化合物对热不稳定,温度过高会使其氧化破坏,所以反应温度选取60℃为宜。

2.3 反应时间对亚硝酸盐清除作用的影响

反应时间对亚硝酸盐清除作用的影响见图3。

图3 反应时间对亚硝酸盐清除作用的影响Fig.3 The effect of reaction time on nitrite scavenging rate

由图3可知,随反应时间的增加,青稞多酚对亚硝酸盐的清除率呈增加趋势。但超过30 min时,随反应时间的增加,青稞多酚对亚硝酸盐的清除作用增加不明显。这是因为在30 min内,反应时间的增加,反应物分子间的碰撞机率增大,清除作用增加。在30 min后,多酚已经基本反应完毕,清除率变化不明显,因此反应时间选取30 min为宜。

2.4 青稞多酚清除亚硝酸盐的响应面优化

在单因素试验结果的基础上,以反应温度(X1)、反应时间(X2)和青稞多酚用量(X3)3个因素为自变量,设计三因素五水平试验。试验设计和结果见表1和2。

利用Design Expert软件对试验结果进行分析,得到回归模型如下:

表1 因素水平表Table 1 Independent variables and test design levels

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Design and result of central composite design

根据试验结果进行方差分析,由表3可知,该模型的 F=42.91,P<0.000 1,说明回归模型高度显著,失拟项P=0.142 5>0.05,说明失拟项不显著,说明回归方程与实际情况拟合良好,能够反映亚硝酸盐的清除作用与青稞多酚用量、反应温度和反应时间的关系。回归模型方差分析表见表3。

表3 回归模型方差分析表Table 3 Variance analysis of the regression equation

2.4.1 响应曲面图分析

根据回归模型做响应面的三维图,如图4所示。

图4 各因素交互作用对亚硝酸盐清除率影响的响应面图Fig.4 Response surface plots of the effects of interactions of various factors on the nitrite scavenging rates

由图4a可知,沿青稞多酚用量轴向等高线更为密集,说明青稞多酚用量对亚硝酸盐清除作用的影响更加显著,青稞多酚用量和反应温度的相互作用对亚硝酸盐清除的影响显著。由图4b可知,反应温度比反应时间显著,曲面相对陡峭。沿反应温度轴向等高线更为密集,表示亚硝酸盐的清除率对反应温度的变化敏感,反应温度和反应时间的相互作用对亚硝酸盐清除的影响不显著。由图4c可知,青稞多酚用量比反应温度更加显著,曲面相对陡峭。沿青稞多酚用量轴向等高线密集,而反应时间轴向等高线稀疏,说明亚硝酸盐清除率对青稞多酚用量变化比对反应温度的变化更为敏感,青稞多酚用量和反应时间的相互作用对亚硝酸盐清除的影响不显著。

2.4.2 验证试验

利用Design-Expert得到各个因素组合最佳工艺条件为青稞多酚用量1.11 mL,在59.04℃的条件下,反应33.5 min,对亚硝酸盐的清除率的理论值为63.72%。考虑操作的实际,修正3个数据组合为青稞多酚用量1.1 mL,反应温度59℃,反应时间34 min,在该条件下,进行了验证试验,得到青稞多酚对亚硝酸盐的清除率为64.04%(RSD=0.46%),与理论值十分接近,说明该方程与实际情况拟合很好,充分验证了所建模型的正确性,此工艺条件准确可靠。

2.5 云南10种小杂粮多酚对亚硝酸盐清除率

云南10种小杂粮多酚对亚硝酸盐清除率见图5。

图5 云南10种小杂粮多酚对亚硝酸盐清除率Fig.5 Nitrite scavenging rates of 10 small grains polyphenols in Yunnan province

研究发现阿魏酸为谷物中主要的多酚化合物[5-7],所以本文采用青稞多酚清除亚硝酸盐的工艺条件比较10种小杂粮多酚对亚硝酸盐的清除作用。由图5可知,在最佳工艺条件下,10种小杂粮中多酚对亚硝酸盐清除范围为23.90%~86.24%,黑米多酚(86.24±1.00)%和紫米多酚(83.59±1.53)%对亚硝酸盐的清除能力显著高于其他小杂粮多酚(p<0.05),藜麦多酚(23.90±2.42)%对亚硝酸盐的清除能力显著低于其它小杂粮多酚(p<0.05)。这可能是不同小杂粮中含有的多酚种类和组成有差异,不同多酚类化合物所含的酚羟基数量及位置不同,影响到其对亚硝酸盐的清除作用。

3 结论

本研究通过单因素试验和响应面优化得到最佳条件为青稞多酚用量1.1 mL,反应温度59℃,反应时间34 min,对亚硝酸盐的清除率为64.04%。10种小杂粮中多酚对亚硝酸盐清除范围为23.90%~86.24%,其中黑米(86.24±1.00)%和紫米(83.59±1.53)%对亚硝酸盐的清除作用显著高于其他小杂粮(p<0.05),藜麦(23.90±2.42)%对亚硝酸盐的清除作用显著低于其它小杂粮(p<0.05)。小杂粮多酚对亚硝酸盐清除作用的机理还有待进一步研究,因而后面的研究可进一步对小杂粮提取物进行分离纯化,并探讨它们对亚硝酸盐清除作用的构效关系,为小杂粮的开发和综合利用提供理论依据。

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