小鼠胚胎移植技术优化及对巨细胞病毒净化研究

杜 凯 李文光 吴德国 赵德明

(1.中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京 100101)(2.中国农业大学,北京 100094)

实验动物是相关科学研究重要的、不可或缺的实验材料，动物的质量可直接反映出科研水平的高低[1]。小鼠巨细胞病毒可导致小鼠肺炎，感觉神经性耳聋，眼内感染，心脏感染(心包心肌炎、营养不良性心脏钙化，皮肤感染疱疹)，脑炎，肝炎等[2-4]，对毒理学、免疫学、药理学、肿瘤学等试验会产生影响。因此，从事相关试验研究使用的小鼠需要排除小鼠巨细胞病毒的感染。

1 材料与方法

1.1 小鼠来源

结扎鼠、供体鼠、受体鼠来源于遗传发育所动物中心。待净化鼠：C57小鼠,经检测种群感染小鼠巨细胞病毒。

1.2 实验药品

PMSG、hCG分别购自宁波第二激素厂和SIGMA公司，M2操作液、M16培养液和二甲基亚砜(DMSO)购自SIGMA公司。

1.3 方法

1.3.1结扎雄鼠的准备：双侧输精管结扎雄鼠。手术1周后，与雌鼠交配，见到阴道栓的雌鼠未怀孕，证明雄鼠结扎成功，可使用。使用时，做好见栓记录，连续4～6次不见栓的结扎鼠以二氧化碳吸入法[5]淘汰处死。

1.3.2供体鼠的超排处理：雌鼠在实验第1天下午16时腹腔注射PMSG，第3天下午16时腹腔注射hCG。注射hCG后，1只雌鼠与1只雄鼠进行合笼。第4天上午8时检查雌鼠阴道是否有栓塞，见栓的鼠作为供体。

1.3.3受体的同期发情处理：假孕雌鼠是通过用结扎雄鼠与受体鼠交配得到的。第3天下午16时，结扎雄鼠与受体鼠合笼交配。

1.3.4胚胎采集、冲洗：在实验的第5天，通过脱颈法处死供体雌鼠，用70%的酒精喷洒腹部，使用眼科剪在腹部中间剪开一个小口。眼科镊夹住剪开的皮肤，向头尾部拉伸使毛发脱离腹腔.。眼科剪剪开腹膜，取出输卵管、子宫，转移到装有M2的平皿上。注射器吸取冲胚液，将胚胎冲出。使用移卵管将胚胎收集起来，转移到含新鲜M2的培养液中，反复洗几次。将胚胎转移至微滴培养皿中，培养液清洗，37 ℃、5%二氧化碳的条件培养暂存。

1.3.5品质鉴定：在胚胎保存液中将胚胎清洗2～3次后，放于显微镜下观察，品质鉴定分为优良胚胎、普通胚胎、不良胚胎和不可用胚胎，其中优良胚胎和普通胚胎为可用胚胎。

1.3.6胚胎移植：交配后0.5～3.5 d的单细胞发育到囊胚阶段的胚胎，可以移植到假孕雌鼠的生殖道内使其继续发育。1.5 d的胚胎可以移植到假孕1.5 d小鼠的输卵管壶腹部，而3.5 d的胚胎可以移植到2.5 d或3.5 d假孕雌鼠的子宫内。

1.3.7检测:受体鼠产仔后，利用已报道的小鼠巨细胞病毒PCR检测方法[6]进行检测。

1.4 试验

1.4.1不同厂商激素的对比试验:按照1.3.2介绍的超排方法进行，使用不同厂商、不同剂量的激素进行超排处理，对比得到的胚胎数量，以及优良胚胎和正常胚胎占到总胚胎数量的比率。选取的两家PMSG、HCG厂家为：SIGMA、宁波第二激素厂。剂量分别选取5、7.5、10IU。

1.4.2小鼠不同发情周期注射激素的对比试验:选取不同发情周期的供体小鼠注射PMSG，后续超排按照1.3.2方法进行，对比超排出受精卵的数量，用以确定选取哪个发情周期的小鼠进行超排处理。

1.4.3受体鼠品系的对比试验:选取C57、ICR、C57雄性与ICR雌性交配的子一代(CIF1代)以及C57雌性与ICR雄性交配的子一代(ICF1代)作为受体鼠，利用输卵管移植法移植C57小鼠2细胞的胚胎，双侧输卵管移植，移植相同数量的胚胎，对比仔鼠出生后的移植率。

1.4.4输卵管移植与子宫移植产仔率的对比试验:选取C57小鼠，随机分成两组。分别进行输卵管移植和子宫移植，均进行双侧移植。产仔后计算产仔数量，得出产仔率。

1.4.5不同时期胚胎通过输卵管移植的成功率试验:采集的C57小鼠的单细胞、2细胞和8细胞胚胎，进行输卵管移植，移植到ICR母鼠的输卵管内，观察受体鼠的妊娠率，用以评价不同时期的胚胎对输卵管移植成功率的影响。

1.4.6输卵管移植移植胚胎数量的对比试验:选取品质在优良、正常的2细胞胚胎，移植到受体鼠的输卵管内，每只小鼠移植12、24、32枚胚胎，观察受体鼠的产仔率，用以评价移植胚胎数目的不同对输卵管移植效果的影响。

2 结果

2.1 不同厂商激素的对比试验结果

按照1.3.2介绍的方法分别对8周C57小鼠60只使用不同厂商、不同剂量的激素进行超排处理，对比得到的胚胎数量，以及优良胚胎和正常胚胎占到总胚胎数量的比率。由表1可知，使用SIGMA生产的激素超排效果无论从可用胚胎数和可用胚胎比率看，均明显优于宁波第二激素厂。SIGMA产激素超排不同剂量间可用胚胎比率差别不大，使用10IU剂量超排C57小鼠的优良、正常胚胎数约17枚/只。

表1 不同厂商不同剂量的激素对比试验结果Table 1 Results of different hormones in different manufacturers

2.2 小鼠不同发情周期注射激素的对比试验结果

每组分别选取10只发情间期、发情前期、发情期、发情后期8周的C57小鼠，按照1.3.2介绍的方法进行超排处理，SIGMA产激素使用10IU，对比得到的胚胎数量，以及优良胚胎和正常胚胎占总胚胎数量的比率。由表2可知，在小鼠的发情间期超排，得到的优良、正常胚胎数量最多，平均每只小鼠获得约23枚胚胎。

表2 不同发情周期注射激素的对比结果Table 2 Results of injection hormones in different estrous cycles

2.3 受体鼠品系的对比试验结果

选取8周的C57、ICR、CIF1代和ICF1代的受体鼠，采用输卵管移植方法，双侧输卵管移植，移植25枚2细胞胚胎，待仔鼠出生后计算产仔数量，得出4种不同品系的小鼠的产仔率分别为37.5%、42%、44.5%和43.5%。由表3可知，CIF1代小鼠作为受体产仔率较高。

表3 受体鼠品系的对比结果Table 3 Results of recipient mouse strains

2.4 输卵管移植与子宫移植产仔率对比试验结果

选取17只ICR小鼠，随机分成两组，分别进行输卵管移植和子宫移植，均进行双侧移植，其中输卵管移植ICR母鼠10只共移植251枚优良、正常胚胎，子宫移植受体母鼠7只共移植211枚C57小鼠胚胎。由表4可知，输卵管移植和子宫移植分别产仔102只、58只，产仔率分别为40.64%、27.49%。

表4 不同移植方法产仔率对比试验结果Table 4 Results of different transplantation methods in birth rate

2.5 不同时期胚胎通过输卵管移植的成功率试验结果

采集C57小鼠的单细胞、2细胞和8细胞胚胎，进行输卵管移植，移植到ICR母鼠的输卵管内，观察受体鼠的妊娠率，由表5可知，移植2细胞胚胎的妊娠率最高，达到了80%，而移植单细胞和8细胞的妊娠率分别为50%和40%。

表5 移植不同时期胚胎的对比试验结果Table 5 Results of embryo transfer in different periods

2.6 输卵管移植移植胚胎数量的对比试验结果

选取品质在优良、正常的2细胞胚胎，移植到受体鼠的输卵管内，每只小鼠移植12、24、32枚胚胎，以观察受体鼠的产仔率。由表6可知：当受体鼠移植24枚胚胎时，产仔率最高达到了43.75%，而移植12、32枚胚胎的产仔率分别为37.5%和34.38%。

表6 移植数量的对比试验结果Table 6 Results of different numbers of embryo transfer

2.7 仔鼠的检测结果

仔鼠出生后，眼角静脉丛采集抗凝血。利用小鼠巨细胞病毒PCR检测方法进行检测，结果显示均为阴性，见图1。说明感染小鼠巨细胞病毒的SPF级小鼠，经过建立优化的胚胎移植净化方法，成功排除了小鼠巨细胞病毒的感染。

图1 PCR检测结果注：M:D2000 Marker;1:阳性对照;2:阴性对照;3:样品1;4:样品2;5:样品3;6:样品4;7:样品5Fig.1 Results of PCRNote：M:D2000 Marker;1:Positive control;2:Negative control;3:Sample1;4:Sample2;5:Sample3;6:Sample4;7:Sample5

3 讨论

用于小鼠净化的方法主要为药物净化、剖腹产净化和胚胎移植净化[7-9]。药物净化有一定的作用[10]，净化不理想，难以达到目的。剖腹产净化主要难点在于较难判断母鼠的妊娠期，而且仔鼠的气味会影响其代乳过程中的存活和育成，有的病毒(如淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒)可通过胎盘造成净化的失败。胚胎移植技术逐渐受到试验人员的重视。小鼠的胚胎透明带可形成一道天然的屏障，能有效地抵御细菌、病毒的侵入[11]，能通过胎盘屏障的病原体也不能穿透透明带，且胚胎在供体鼠体内时间很短，也有效降低了母子间垂直传播的可能性，同时在胚胎移植过程中的冲洗步骤还能有效减弱或消除病原体的活力[12]，这些极大地增加了对病原体净化的有效性，为排除小鼠巨细胞病毒奠定了坚实的基础[13]。

本文利用优化的胚胎移植净化技术对感染了小鼠巨细胞病毒的SPF级小鼠进行了胚胎移植净化，获得了无小鼠巨细胞病毒感染的SPF级小鼠。