利用引物探针序列构建转基因马铃薯检测阳性重组质粒及其验证

杨杰 李兰 戴莉 张江国 莫善明 徐新龙

摘要 [目的]通过将特定转基因检测方法引物和探针序列重组拼接，并将重组序列连接至质粒中，验证其作为转基因检测阳性对照的可行性。[方法]通过搭桥PCR和全基因合成的方法制备阳性重组序列，验证阳性重组序列作为阳性对照品的可行性与阳性重组质粒的均一性、稳定性。[结果]通过将引物探针序列顺序拼接构建得到的阳性重组质粒的性状均一，在4和-20℃条件下均能稳定产生阳性结果。[结论]该种阳性重组质粒的构建方法能够满足转基因成分检测方法中阳性对照品的要求。

关键词 引物;探针序列;转基因检测;搭桥PCR;阳性重组质粒

中图分类号 Q 943.2文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）23-0213-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.062

開放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Construction of Transgenic Potato Detection Positive Recombinant Plasmid by Primer Probe Sequence and Its Validation

YANG Jie，LI Lan，DAI Li et al

（Technical Center of Alashankou Customs，Alashankou，Xinjiang 833418）

Abstract [Objective]The primers and probe sequences of specific GMO detection method were recombined and spliced， and the recombinant sequences were linked to the plasmid.To verify its feasibility as a positive control for GMO detection.[Method]Positive recombinant sequences were prepared by overlap PCR and whole gene synthesis to verify the feasibility of using positive recombinant sequences as positive reference materials and the homogeneity and stability of positive recombinant plasmid.[Result]The positive recombinant plasmids constructed by sequential splicing of primer probe sequences were uniform in character and could produce stable positive results at 4 ℃ and -20 ℃.[Conclusion]The construction method of the positive recombinant plasmid can meet the requirements of the positive control in the detection of GMO.

Key words Primer;Probe sequence;GMO detection;Overlap PCR;Positive recombinant plasmid

随着PCR技术的发展，基因检测技术现已广泛应用于医疗卫生、食品安全等各个领域。但由于PCR检测过程中对检测目标的不能直观可见，为了保证检测结果的准确可靠，在检测环节中阴性、阳性及空白对照组的设立直接关系到检测的判定。对一个检测实验室来说，阳性对照物的获得往往是一个检测工作能否顺利开展的关键因素。

在一个定性PCR检测工作中，一般采用标准物质作为检测的阳性对照组。用作PCR检测的标准物质根据来源一般可分为3类[1]：第1类是基体标准物质，通常是以含有目标检测物的植物组织或植物产品经粉碎加工制成的粉末，使用时一般在检测过程中与测试样品一同处理进行核酸提取并进行PCR检测;第2类是含有目标检测物基因组DNA/RNA溶液，使用时可以作为某检测样品全部内外源检测片段的阳性对照模板;第3类是含有目标检测物某个检测片段基因序列的标准质粒分子，使用时需要根据所检测的基因片段选择所需的标准质粒分子[2]。

根据Taqman探针实时荧光PCR检测的原理，检测方法的特异性是由其引物探针的序列特征决定的[3]，而引物探针区域之间的序列对扩增和检测结果并不会造成明显影响。据此，该研究通过将特定检测方法引物探针序列重组拼接合成，即可获得一段能用作该检测方法阳性对照的DNA序列;再通过搭桥PCR和全基因合成技术[4]，将具体检测标准中全部被测基因阳性重组序列顺序拼接并进行连接至克隆载体上复制克隆，可得到一个适用于具体检测方法中全部检测片段的阳性重组质粒，从而形成一套不依靠阳性样品获得同时既方便易得又通用可靠的阳性质粒的制备方法。

1 材料与方法

1.1 阳性物质

试验使用转基因阳性玉米样品为2016年由中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织的粮食转基因检测能力验证计划（计划编号：ACAS-PT215）中检出的阳性转基因玉米粉，转基因阳性马铃薯样品为2015年辽宁出入境检验检疫局组织的能力验证项目（计划编号PTC-T112）中阳性转基因品系EH92-527-1马铃薯淀粉。

1.2 试剂设备

植物基因组DNA提取试剂盒DP305、2×Taq PCR MasterMix PCR预混液，天根生物技术有限公司;高效 DNA 凝胶回收试剂盒，GeneView公司;

D-5琼脂糖凝胶、LM SIEVE低熔点琼脂糖凝胶及荧光标记探针，宝生物工程（大连）有限公司;LightCycler 480 Probes Master PCR预混液，罗氏诊断产品（上海）有限公司;序列合成及序列测定为北京鼎国生物技术有限公司。 荧光定量PCR仪为罗氏LightCycler 96。

1.3 NOS终止子基因阳性重组序列的搭桥PCR连接及验证 将SNT 1198—2013 《转基因成分检测 马铃薯检测方法》[5]中NOS终止子基因检测引物探针序列拼接为84 bp的阳性重组序列（GTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAAACGCGATAGAAAACAAAATATAGCG），由于片段过长，不易直接合成，拆分为NU片段（GTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGAGAT

GGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCA）、ND片段（CGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGTTTGCGGGACTCTAATCATAAA

AAC）两段序列进行搭桥PCR连接。

将合成好的NU和ND片段稀释为10-6 μmol/L，以10 μmol/L SN/T 1198—2013 《转基因成分检测 马铃薯检测方法》中NOS终止子基因检测引物为上下游引物PCR反应体系按照20 μL体系：ddH2O 6 μL、MasterMix 10 μL、上下游引物各1 μL、模板各1 μL進行配制，反应程序：95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，35个循环。配制2%的琼脂糖凝胶进行电泳，并回收80 bp左右电泳条带。

将回收的PCR产物进行稀释后作为模板对NOS终止子基因进行检测，以SN/T 1198—2013 《转基因成分检测 马铃薯检测方法》中规定进行PCR体系配制，反应程序：95 ℃10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。

1.4 CaMV35S启动子基因与NOS终止子基因二元阳性重组序列的连接及验证 设计CaMV35S与NOS连接接头引物C-N：5′-TGACGCACAATCCCACTATCGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTG-3′，以梯度稀释为10-6的NU、ND连接产物为模板，以10 μmol/L 接头引物C-N作为上游引物，SN/T 1198—2013 《转基因成分检测 马铃薯检测方法》中NOS终止子基因检测下游引物为下游引物进行PCR扩增，PCR反应体系按照20 μL体系：ddH2O 6 μL、MasterMix 10 μL、上下游引物各1 μL、模板2 μL进行配制，反应程序：95 ℃10 min;95 ℃15 s，60 ℃60 s，35个循环。配制2%的琼脂糖凝胶进行电泳，并回收90 bp左右电泳条带。

设计合成CaMV35S阳性重组序列C0：5′-GCTCCTACAAATGCCATCATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCATGACGCACAATCCCACTATC-3′，以NU、ND拼接后带接头产物和C0为模板，以10 μmol/L SN/T 1198—2013 《转基因成分检测 马铃薯检测方法》中CaMV35S启动子基因上游引物、NOS终止子基因下游引物为上下游引物进行搭桥PCR连接。PCR反应体系按照20 μL体系：ddH2O 6 μL、MasterMix 10 μL、上下游引物各1 μL、模板各1 μL进行配制，反应程序：95 ℃10 min;95 ℃15 s，60 ℃60 s，35个循环。配制2%的琼脂糖凝胶进行电泳，并回收140 bp左右电泳条带。

将回收的PCR产物进行稀释作为模板对CaMV35S启动子基因和NOS终止子基因进行检测，以SN/T 1198—2013 《转基因成分检测 马铃薯检测方法》中规定进行PCR体系配制，反应程序：95 ℃10 min;95 ℃15 s，60 ℃60 s，40个循环。

1.5 转基因马铃薯外源基因引物探针序列重组阳性质粒的构建及验证

1.5.1 基因马铃薯外源基因阳性重组序列的设计。

根据SNT 1198—2013《转基因成分检测 马铃薯检测方法》中表A.2中实时荧光PCR定性检测转基因马铃薯成分引物和探针序列，将CaMV35S、FMV35s、NOS、NPTII、CP4 EPSPS、PLRVrep、PVYep、Cry3A、EH92-527-1全部9个外源基因拼接为完整的阳性重组序列。

为区别检测阳性结果中是否发生阳性重组序列的污染，因此在CaMV35S探针序列和下游引物序列间插入一段外源序列5′-TATGAGCCTGGAGCGCA-3′作为标记探针LLI，利用以该序列设计的探针进行检测，可以将阳性重组序列与阳性转基因产品区分开。序列信息见表1。

1.5.2 转基因马铃薯外源基因阳性重组质粒的正确性验证。将重组序列送交北京鼎国生物技术有限公司进行全基因序列合成，并连接至pES载体，转化至受体菌DH5α中进行克隆并测序验证。

1.5.3 转基因马铃薯外源基因阳性重组质粒的均匀性验证。

将验证正确的转化体进行摇培，提取阳性重组质粒。将提取得到的阳性重组质粒稀释到10 ng，分装为100份的管中，随机挑选其中重组质粒15份，按照SNT 1198—2013《转基因成分检测 马铃薯检测方法》规定体系和程序对外源基因进行检测，分析检测结果Ct值的平均值标准偏差和相对标准偏差是否符合使用要求。

1.5.4 转基因马铃薯外源基因阳性重组质粒的稳定性验证。

将标准物质放置在4、-20 ℃条件下进行保存，分别在7、15、30、90 d时，按照SNT 1198—2013《转基因成分检测 马铃薯检测方法》规定体系和程序对外源基因进行检测。

1.5.5 重组质粒进行转基因样品检测效果的验证。

分别提取50 mg含有转基因马铃薯EH92-527-1品系成分的淀粉样品、转基因玉米阳性样品、非转基因马铃薯样品的基因组DNA各一份，按照SNT 1198—2013《转基因成分检测 马铃薯检测方法》规定体系和程序对其内外源基因进行筛查检测。使用非转基因马铃薯基因组DNA作为阴性对照组模板，阳性重组质粒作为阳性对照组模板。同时对样品和对照组进行标记探针的检测，检测使用SNT 1198—2013《转基因成分检测 马铃薯检测方法》中CaMV35S上下游引物和标记探针LLI，反应程序：95 ℃10 min;95 ℃15 s，60 ℃60 s，40个循环。

2 结果与分析

2.1 NOS终止子基因阳性重组序列的搭桥PCR连接 NU、ND片段搭桥PCR产物电泳结果见图1。回收连接产物进行NOS终止子基因检测结果见图2。结果表明，搭桥PCR成功将NU、ND片段连接为完整的NOS基因阳性重组序列，序列能够对NOS终止子基因的实时荧光PCR检测方法产生阳性结果。

2.2 二元阳性重组序列的连接

NOS终止子基因阳性重组序列通过PCR加C-N接头后与C0搭桥PCR连接合成CaMV35S启动子-NOS终止子二元阳性重组序列，电泳结果见图3。

对连接产物进行CaMV35S启动子、NOS终止子基因检测结果见图4。结果表明，二次搭桥PCR成功将连接得到的NOS阳性重组序列与CaMV35S陽性重组序列连接产物能够有效对CaMV35S启动子、NOS终止子基因的实时荧光PCR检测方法产生阳性结果。

2.3 转基因马铃薯外源基因引物探针序列重组阳性质粒的构建及验证

根据北京鼎国昌盛生物技术有限公司全基因合成试验服务结题报告（报告编号：KT17227），试验成功构建含有目的基因全序列628 bp的pES质粒载体，并成功转化克隆至受体菌DH5α中，插入片段经PCR扩增和测序检验与目标序列一致。

经检测，全部15份阳性重组质粒均能够稳定呈现阳性检测结果且Cq值稳定（表2），阳性重组质粒在4、-20℃条件下均稳定呈现阳性结果（表3），符合检测均匀性和稳定性的要求。通过将重组阳性质粒作为阳性对照品对转基因样品进行检验，结果发现（图5和表4），EH92-527-1阳性样品内源基因、外源NOS终止子、NPTII、EH92-527-1基因呈阳性，其余外源基因呈阴性;转基因阳性玉米样品CaMV35S启动子、NOS终止子、CP4-EPSPS、Cry3A基因呈阳性，其余外源基因呈阴性;阳性重组质粒外源基因均呈阳性，内源基因呈阴性，结果正常;并且标记探针LLI检测仅阳性重组质粒结果呈阳性。

3 讨论

3.1 通过引物探针序列重组阳性质粒的应用

随着分子生物学技术的普及，实时荧光PCR检测方法已经逐渐扩展到生物科学、医学、农业科学、食品科学等各个领域[6]，其高灵敏度、高分辨率、快速便捷、规范性操作等优势在对检验检测标准化需求日渐严格的今天更加凸显出来。但由于PCR检测过程中的检测目标的不能直观可见，需要对在全过程中可能影响检测结果因素逐一进行验证排除，因此在各个检测环节中合理设置阴性、阳性及空白对照组直接关系到检测结果的可靠性与否。根据现行有效的国家标准[7-8]，在转基因检测过程中需要设立阳性目标DNA对照、阴性目标DNA对照、PCR抑制对照、扩增试剂对照、提取空白对照、阳性提取对照、环境对照这七大类对照组试验。其中阳性目标DNA对照、PCR抑制对照、阳性提取对照3类对照组均需要使用对应每个检测目标基因的阳性对照品来开展试验。可以说如果一个实验室想要建立一个实时荧光PCR检测能力，阳性对照品的获得是其能否成功的关键因素。

以往检测过程中所使用的阳性物质一般为各类标准物质或经权威机构确认鉴定的阳性样品，这些阳性样品能够满足不同情况的使用需求。但从实际工作出发，检测机构的检测需求千变万化，受不同时间空间等因素的影响很大，而各类标准物质获得本质上都基于阳性样品的获得。对于没有市售途径、收到贸易制约、上市时间久远或生物安全风险较高的阳性样品往往难于获得。在有检测需求时却不能及时获得合适的阳性对照品很有可能会成为制约一个检测机构检测能力发展的重要因素。

基于水解探针法的实时荧光PCR原理，通过将具体检测方法中所使用的引物探针序列进行顺序拼接重组而构成的阳性重组质粒能够以几十至数百元的成本，在十几天的周期内就获得任一检测方法所需要的阳性物质。且这种阳性物质具有高度的方法专一性，对于不同检测方法间不会产生污染，并且能够通过序列设计在每种阳性质粒中插入独立标记序列，实现阳性结果的可识别可追溯。此外，通过对特定检测标准方法建立对应的阳性质粒，可以有效帮助标准方法的实施，促进检测工作标准化的进行。

3.2 存在的问题及改进方向

首先，实际工作应用中，应当先进行重组序列的构造设计，每一个阳性序列可以按照上游引物序列、探针序列、下游引物反向互补序列的顺序拼接在一起。当需要设计多个序列时可以直接拼接，还可以对不同重组序列片段进行比较，将序列末端相同的若干基因序列进行压缩碱基拼接，以达到减小片段长度的目的。

其次，在序列合成时，可以根据检测的需求，对于阳性序列的获得采用不同的方式：对于70 bp以下可以考虑直接化学合成，对于70～200 bp可以考虑通过搭桥PCR的方式多次拼接，对于200 bp以上的多元阳性重组可以采用全基因合成的方式。但由于100 bp以下的oligoDNA片段在试验操作中较容易产生气溶胶，对于试验空间、试验条件、试验操作较为有限的实验室会有较大的风险形成阳性气溶胶污染[9]，通过将阳性序列分解为不具备完整扩增产物的片段进行搭桥PCR连接能够更好地避免污染。如果出于操作流程和防污染的角度出发，将5～12个阳性重组序列进行拼接构建一个长片段进行全基因合成能够更加方便快捷，成本也更低。

第三，在3類阳性对照组中，阳性对照的主要功能是确保扩增体系溶液配制正确，溶液中不含抑制扩增反应的成分，重组阳性质粒能完全胜任阳性目标DNA对照、PCR抑制对照组的功能。但是阳性提取对照仅能使用阳性样品或阳性基体标准物质作为阳性对照品。设立阳性提取对照的目的是确保在DNA提取过程中保障模板DNA提取的质量，确保被测目标基因序列不因提取方法的不当导致假阴性结果的产生。但一般的实时荧光PCR检测方法中都会加入内源基因的检测组，通过内源基因Ct值的大小限制确保样品DNA模板提取的浓度满足检测需求，这在很大程度上就足以代替阳性提取对照组的功能。

第四，由于引物探针序列重组阳性质粒本身并不是目标扩增的全长片段，通常情况下会略短于全长片段，因此与标准物质相比可能存在影响扩增效率的潜在因素。但出于常规实时荧光PCR引物探针设计原则[10]，其扩增片段长度与引物探针区间序列不应对扩增结果产生较大影响，因此重组序列应当能满足大多数定性检测方法的需求。

第五，对于实时荧光定量PCR而言，重组质粒与目标扩增的全长片段在扩增效率上的影响需要更进一步的定量分析，未经验证的重组质粒可能不应直接用于定量检测结果的分析，以避免重组序列构建对定量结果的不确定性影响。

参考文献

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[4] 杨宇，吴元华，郑雅楠.利用重叠延伸PCR技术进行DNA的人工合成[J].安徽农业科学，2006，34（9）：1810-1811.

[5] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.转基因成分检测 马铃薯检测方法：SN/T 1198-2013[S].北京：中国标准出版社，2013.

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[7] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.转基因产品检测 通用要求和定义：GB/T 19495.1—2004[S].北京：中国标准出版社，2007.

[8] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.转基因产品检测 实验室技术要求：GB/T 19495.2—2004[S].北京：中国标准出版社，2007.

[9] 彭志领，王建华. RT-PCR技术常见问题的分析[J].河南畜牧兽医， 2002（1）：38.

[10] GIULIETTI A，OVERBERGH L，VALCKX D，et al.An overview of real time quantitative PCR：Applications to quantify cytokine gene expression[J].Methods，2001，25（4）：386-401.