急性缺血性卒中患者血清miRNA-148a表达水平检测及其临床价值预探索

郭桂珍，韩荣胜，王有清，刘庆春

急性缺血性卒中（acute ischemic stroke，AIS）是神经内科最常见的危重症之一，其致死率和致残率均较高[1]。据统计数据显示，我国每年新增卒中患者近200万例，其中接近80%为缺血性卒中[2-3]。因此，进一步探讨AIS可能的分子标志物显得十分重要。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度为19～25 bp的小分子RNA，可在转录后水平对基因表达进行负调控，从而参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程[4]。miRNA-148a定位于7号染色体7p15．2，与炎症免疫性疾病和肿瘤的发生发展密切相关[5]。近期研究也发现，miRNA-148a可调节组织的缺血预适应损伤，并与创伤性脑损害的病理过程有关[6-7]。然而，关于miRNA-148a在AIS中的表达水平及临床价值尚未见报道。本研究通过分析AIS患者外周血血清的miRNA-148a水平及临床资料，以探讨miRNA-148a在AIS发病和病情评估方面的潜在价值；同时，运用生物信息学方法预测miRNA-148a可能的调节机制，为后续研究提供理论基础。

1 研究对象与方法

1．1 研究对象 本研究为前瞻性研究，选取2017年10月-2018年4月青海省第五人民医院神经内科收治的AIS患者42例为观察组，其中男性25例，女性17例，平均年龄62．4±9．3岁。纳入标准：①年龄40～85岁，首次发病且发病至入院时间＜12 h；②AIS的诊断符合2014年中国急性缺血性卒中诊治指南[3]。排除标准：①合并出血性卒中、颅内血管畸形等神经系统疾病；②合并心绞痛、心肌梗死、感染、炎症免疫性疾病、恶性肿瘤、血液病等；③严重心力衰竭、严重肝肾功能不全者；④近期口服免疫抑制剂、糖皮质激素或细胞毒性药物。选取于本院体检中心接受体检且确定无全身疾病者42例为健康对照组，根据年龄和性别与观察组进行1∶1匹配。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象均知情同意。

1．2 资料收集 收集年龄、性别、高血压史、糖尿病史、吸烟史等基本临床资料，记录AIS患者发病至入院的时间，并根据颅内MRI结果计算梗死灶最大层面直径。其中，直径＜1．5 cm为腔隙性脑梗死，1．5～5．0 cm为中等面积脑梗死，＞5．0 cm为大面积脑梗死[8]。收集患者生化指标检测结果，包括LDL-C、HDL-C、入院血糖、Cr、hs-CRP等。

所有研究对象至医院后即刻抽取其肘静脉血5 mL于非抗凝管中，3000 g×15 min离心，取上清液分装于离心管中并储存于-80 ℃冰箱，以便统一检测miRNA-148a水平。采用Trizol裂解液提取血清样本的总RNA，RNA反转录合成cDNA。然后以cDNA为模板采用实时定量聚合酶链反应技术进行基因片段扩增，仪器为Bio-Rad iQ5实时荧光定量聚合酶链反应仪。其中，miRNA-148a的上游引物序列为5'-TCAGTGCACTACAGAACTTTGT-3'，下游引物序列为5'-GCTGTCAACGATACGCT ACGT-3'。U6核小分子RNA作为内参基因，其上游引物序列为5'-CGCTTCGGCAGCACAT ATA-3'，下游引物序列为5'-TTCACGAAT TTGCGTGTCAT-3'。反应条件为：95 ℃预变性30 s，40个循环（95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s）。miRNA-148a的相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。

1．3 公共数据分析 从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）（https：// www．ncbi．nlm．nih．gov/geo）下载数据集GSE55937[9]。该数据集共收集24例AIS患者和24例健康对照者的外周血样本，采用Affymetrix公司的Multispecies miRNA-3 Array芯片进行检测，平台号为GPL16384。下载数据为CEL格式，采用R软件的affy包进行背景校正、数据标准化和log2转换后用于后续分析。

1．4 生物信息学分析 采用miRDB、miRTar Base和TargetScan数据库分别对miRNA-148a的靶基因进行预测，其结果取交集后得到最终的靶基因。采用Cytoscape 3．6．0软件构建miRNA-148a的靶基因调控网络。然后，利用DAVID 6．8在线工具对靶基因进行富集分析，包括基因本体论（gene ontology，GO）-生物学过程、京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路，其结果用超几何分布进行统计学检测。

1．5 统计学方法 采用GraphPad 6．0软件进行统计学分析。采用Kolmogorov-Smirnov法进行正态检测，所有计量资料均符合正态分布，用表示，其组间比较采用独立样本t检验。计数资料用频数（%）表示，其组间比较采用χ2检验。采用Spearman相关性检验分析miRNA-148a水平与AIS患者临床资料之间的关系。绘制miRNA-148a对AIS诊断的受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，以曲线下面积反映其诊断效能。P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 miRNA-148a在急性缺血性卒中患者中的表达 AIS组患者入院时的血清miRNA-148a相对表达量为0．76±0．23，而健康对照组的miRNA-148a相对表达量为1．02±0．21，差异具有统计学意义（t=5．392，P＜0．001）。ROC曲线分析提示，miRNA-148a诊断AIS的曲线下面积为0．79（95%CI0．70～0．89，P＜0．001）（图1）。

2．2 miRNA-148a与急性缺血性卒中患者临床资料的相关性 根据AIS患者miRNA-148a相对表达量的中位数将其分为低水平组（＜0．74，n=21）和高水平组（≥0．74，n=21），结果表明两组患者的脑梗死面积、HDL-C和hs-CRP水平存在显著差异（表1）。Spearman相关性分析提示AIS患者的miRNA-148a水平与脑梗死面积（r=-0．34，P=0．03）和hs-CRP（r=-0．43，P=0．005）均负相关，而与其他临床资料无关。

2．3 GSE55937数据集中miRNA-148a的表达在公共数据集G SE55937中，A IS患者的miRNA-148a相对表达量为1．93±0．46，而对照组的miRNA-148a相对表达量为2．52±1．00，差异具有统计学意义（t=2．64，P=0．011）。ROC曲线分析表明，miRNA-148a诊断AIS的曲线下面积为0．69（95%CI0．54～0．84，P=0．022）（图2）。

2．4 生物信息学分析 miRDB、miRTarBase和TargetScan 三个数据库同时预测到58个miRNA-148a的靶基因，包括WNT10B、DNMT1等（图3）。GO和KEGG富集分析提示，这些靶基因主要涉及的生物学过程包括细胞凋亡的正向调控、神经元分化以及凋亡相关的线粒体膜蛋白插入的正向调控等，主要涉及的信号通路包括叉头框转录因子O亚族信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路、转化生长因子-β信号通路等（表2）。

表1 不同miRNA-148a水平组急性缺血性卒中患者的临床资料比较

图2 GSE55937数据集中miRNA-148a的表达情况（左）及其诊断急性缺血性卒中的受试者工作曲线（右）

图3 miRNA-148a的靶基因预测（左）及其调控网络（右）

3 讨论

目前，AIS的发病率在我国乃至世界范围内仍居高不下，严重威胁人类健康并加重社会负担。因此，寻找AIS有效的生物标志物有重要临床意义。外周血miRNA相对稳定、不易降解且其检测方法较为敏感、准确，可作为临床疾病潜在诊断和病情鉴别的新型标志物[10]。既往研究提示，miRNA在神经系统发育和功能上起到重要作用[11]。miRNA与神经系统疾病的关系也是近年来的热点研究问题，而脑血管疾病患者的外周血miRNA也存在不同程度的差异表达。例如，Lili Zeng等[12]的研究发现AIS患者外周血的miRNA-210表达水平较对照组显著下降，尤其在发病后第7天和第14天更为明显，可能是诊断AIS的潜在标志物之一。而Jingru Wang等[13]近期的研究提示，miRNA-148/152家族的另一成员miRNA-148b可通过影响Wnt信号通路蛋白，从而参与AIS后的脑组织修复过程。本研究通过分析AIS患者的临床数据和公共数据库数据，均发现miRNA-148a在AIS患者中水平降低，且在一定程度上可反映脑梗死严重程度和炎症水平。

表2 miRNA-148a靶基因的富集分析

通过生物信息学分析，本研究共预测到58个miRNA-148a的靶基因，包括WEN10B、DNMT1等。有研究表明，miRNA-148a可通过与WEN10B直接结合，进而抑制Wnt/β-catenin通路[14]。而DNMT1是miRNA-148a的重要的靶基因[15]。抑制DNMT1则有助于保护脑缺血性损伤[16]。以上这些靶基因主要涉及细胞凋亡、FoxO信号通路、PI3K-Akt通路等分子机制。近年来的观点认为，脑缺血核心区以坏死为主，而缺血程度较轻的半暗带则以凋亡性死亡为主，因此细胞凋亡也是脑缺血造成神经系统损伤的重要机制[17]。FoxO信号通路参与调控细胞抗氧化应激、DNA修复和凋亡等过程[18]。Deyuan Li等[19]研究表明，FoxO信号通路蛋白FOXO3a与脑缺血缺氧模型大鼠的神经细胞凋亡有关，而PI3K-Akt通路则是调节AIS信号转导的重要机制之一，应用PI3K抑制剂LY294002可降低磷酸化的Akt水平，增加脑梗死体积[20]。因此，miRNA-148a可能通过调控WEN10B、DNMT1等靶基因，影响细胞凋亡和FoxO、PI3K-Akt等信号通路，从而参与AIS的发生发展。

在GEO数据库的GSE55937数据集中，AIS组miRNA-148a的表达水平也明显低于对照组，且miRNA-148a对AIS具有一定的诊断效能，表明本研究的结论相对稳定。此外，本研究利用多个miRNA数据库对miRNA-148a的靶基因进行预测，其预测的结果也相对可靠。但本研究仍有以下不足：①临床数据的样本较小且为单中心研究，因此可能导致结果有一定的偏倚；②所采集的样本均为外周血血清样本，不能明确脑组织中miRNA-148a的表达情况，但如前所述，外周血miRNA相对稳定，其检测方法较为敏感准确；③因本研究重点关注miRNA-148a在AIS早期的变化，故未对其进行连续监测，不能明确AIS患者发病后miRNA-148a的动态水平。

综上所述，A IS患者发病早期的血清miRNA-148a降低，在一定程度上可反映脑梗死程度和炎症水平，可能涉及细胞凋亡和FoxO、PI3K-Akt等信号通路。因此，miRNA-148a可能在AIS的诊断及病情评估方面具有一定参考价值。