人体微生物组研究进展

朱家辉

(陕西省西安中学 陕西西安 710018)

1990年启动的人类基因组计划于2003年完成测序工作，随后围绕测序成果开展了进一步的研究工作，这项计划除了发现全部人类基因组约有2.6万个基因外，还发现人类基因组中大约有200多个基因来自于人祖先基因组中的细菌基因，提示了寄生于人体的细菌可能与寄主人体之间发生了遗传信息的交流。另外，人体微生物的数量及基因组数目远超过人体自身。人们通过多年的临床观察及研究发现，人体微生物对人的健康和疾病的发展有重大影响，很多疾病的发病机制涉及多种微生物。由于人体微生物对人类生命活动的影响巨大，将人体微生物的基因组称为人的“第二基因组”，它与人类自身的基因组共同作用，参与人体的发育、营养、代谢、免疫等过程，影响人类健康。

人体微生物组是人体所有微生物群及其遗传物质的总和。2005年，13个国家的科学家在巴黎召开了第一届国际微生物组大会，组建了“国际人体微生物组联盟”，共同协作，助力人类微生物组研究。美国启动了人体微生物组计划(HMP)，产生了超过14.23tb的数据，到2016年，HMP已经发布了超过800个参照微生物基因组序列、超过3万亿bp的微生物宏基因组测序数据、7000多万个16SrRNA序列数据、500多万个特异预测基因。2017年发表在《Nature》上的一项研究工作介绍了HMP的第二波数据，包括1631个新的宏基因组数据，使用更新的分析和组装方法对身体不同部位和时间进行分析[1]。HMP之后，美国国立卫生研究院启动了艾滋病人肺部微生物组计划，随后其他国家也相继开展人体微生物组的大规模项目，包括冈比亚肠道微生物组计划、INRA法国/中国MicroObes项目、加拿大人体微生物组项目、澳大利亚人体微生物组快速启动计划和韩国双胞胎群组微生物组多样性计划。2008年，国际人类微生物组研究联盟(IHMC)成立，全世界都在蓬勃开展人体微生物组相关的研究。这个学科的潜力正在被不断发掘。

本文在总结众多研究成果的基础上，从人体微生物组研究对象的多样性、科学的研究方法及技术、人体微生物组的功能以及人们对微生物组研究成果的应用方面入手，综述这一领域的研究进展，希望能为该领域的研究人员提供较为全面的资料，同时也能帮助有兴趣进行此类研究的科研人员快速了解行业发展趋势。

一、人体微生物组的多样性

HMP计划从健康人体的五大主要部位(口腔、皮肤、呼吸道、肠道、生殖道)采样并提取DNA后发现不同身体部位的DNA提取量差别很大，序列分析表明不同身体部位的微生物结构组成也有差别。我们将重点从人体三个主要部位的微生物结构组成及定植规律等方面分析人体微生物组的生态及多样性。

(一)肠道微生物群落

在HMP进行过程中的研究发现，人肠道样本DNA含量为各部位之首，是DNA含量最少的皮肤样本的百倍以上。人肠道微生物种类和数量可占到人体微生物总量的90%。新生儿的肠道微生物菌群主要来自于母体产道、粪便及体表微生物菌群的垂直传递[2，3]。这些微生物的定殖与发展呈动态变化[4]，一些兼性厌氧微生物，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等在肠道中增殖逐渐形成厌氧的肠道环境。婴儿肠道微生物受多种因素影响，出生第一个月肠道环境发生大的变化会导致某些种类微生物消失，那些到成年阶段仍然存在的微生物成为肠道固有菌群。出生后三年内婴儿的肠道微生物种类不断增加，拟杆菌门逐渐成为优势菌群，肠道微生物的结构组成也逐渐达到成年人水平。由于环境、种族和生活习惯等因素差异，中国人肠道菌群可能有独特的特征。2017年赵立平等人在中国科学院院刊上建议启动“国际华族健康微生物组研究计划”，希望借助从对遗传背景相对稳定，饮食、生活方式不同的人群菌群结构的研究深入揭示慢性病的发病机制[5]。Zhang等人以居住在三个城市的健康成年人粪便为样本，使用宏基因组学方法研究了健康中国人群肠道微生物群落特征，发现了11个核心细菌种属，研究了疾病相关的微生物的分布模式，为中国人群健康肠道微生物组成提供数据基础[6]。

(二)呼吸道微生物群落

曾经，人们以为健康的肺部是无菌的，但下呼吸道纤支镜刷样本中检测到了拟杆菌、厚壁菌、变形杆菌、梭杆菌，并且发现健康肺部与哮喘病人肺内的菌群结构组成不同[7]。呼吸道微生物组守卫着人体健康的大门[8]。Charlson等人从6名健康个体的多个部位采集呼吸道菌群，通过16S rDNA Q-PCR和深度测序分析细菌丰度和组成，发现厚壁菌门的veillonellaceae、拟杆菌门中的prevotellaceae和厚壁菌门链球菌科的微生物是呼吸道中的优势菌群，呼吸道微生物群生物量呈现从上到下减少的趋势，肺部微生物群与上呼吸道菌群无法明确区分[9]。Morris等人为检查健康个体下呼吸道微生物组成，收集口腔洗液和支气管镜下肺泡灌洗液后基于16S RNA进行序列分析，利用群落生态学的中性模型确定肺微生物最可能的存在的细菌，发现肺内鉴定的细菌大部分也在口腔出现，但在几个物种中存在差异[10]。新生儿由母婴垂直传递已建立起呼吸道微生物微环境但是并不稳定。健康人体可通过肺部的固有免疫机制比如黏膜纤毛清除、巨噬细胞吞噬、呼吸道表面可溶性液体的抑制作用，预防吸入的微生物造成感染。

(三)口腔微生物群落

口腔内有舌、咽喉、齿龈及口腔黏膜等黏膜表面和牙釉质表面，以及含有抗菌物质的唾液，为微生物的定殖提供复杂的环境条件。口腔中有上百种微生物，包括细菌、真菌、病毒、原生动物[11]。胎儿出生的时候由产道获得原始菌群，在从新生儿到成人的成长过程中原始菌群经过初始附着、代谢相互作用、信息交换等途径进行定殖并演替。健康口腔定殖菌群如果转移到人体其它环境中具有诱发感染的风险。

二、人体微生物组研究方法及策略

传统的研究方法主要包括分离培养、染色分析及血清学试验等检测手段，由于微生物群落中各微生物丰度不同以及培养条件的不适宜会导致部分低丰度或难培养微生物培养失败而被漏检。微生物的培养是研究个体及群落生理生化特征及功能的必要手段。因此，不断有研究组投入大量精力致力于微生物培养条件的研究优化。根据“尽可能模拟微生物自然生长条件”的培养原则，人们发展出了许多现代、高通量的培养方法，如向培养体系中加入生长环境的成份、加入群落中其它微生物代谢物、加入微生物生长因子、制作“细菌陷阱”等，成功培养了许多难培养微生物。

事实上，由于人们对一些微生物生存条件及代谢情况的不了解，目前仍然存在许多不可培养的微生物。为获得这部分微生物的信息，人们发展了一系列的免培养技术来研究微生物群落结构及基因组信息，如16SrRNA测序[4，12]和宏基因组学等技术[13-16]。

三、人体微生物组的功能

随着经济不断发展和社会进步，人类的疾病谱发生了急剧变化，从以传染病为主逐渐变为传染病和慢性病并重，甚至是慢性病更多地威胁着人类健康。这与人们生活方式和饮食结构的变化有很大关系。如何防治慢性病，维护人类健康是急需解决的重大科技问题。研究证明，与人体共生的微生物菌群对人体健康状态作用重大，其结构失调与多种慢性病的发生相关。2012年华大基因发表了糖尿病人和健康人肠道菌群差异的大规模测序结果；2014年浙江大学的Qin等人发表了肝硬化病人肠道菌群的结构特征[17]；王婷婷等人研究了结肠癌发生发展过程中肠道菌群的变化规律[18]。这些研究结果都说明肠道微生物结构的变化和失调影响人体健康。

(一)与人体代谢的关系

随着宏基因组学、宏转录组学等技术的发展，人体微生物的功能基因逐渐被发掘出来。2006年Steven等人[19]采用鸟枪测序法对人体肠道微生物组进行宏基因组测序分析，与同源基因信息库(COG)对比结果表明，肠道微生物基因组中富含许多人体自身不具备但却是生命活动所需的参与碳水代合物、甲烷生成、氨基酸、维生素和短链脂肪酸代谢有关的基因。一项基于多组学的系统分析表明肠道菌群失调对儿童遗传和单纯性肥胖都有重要的病因贡献[20]。Gosalbes等人[21]采用宏转录组技术对10名健康志愿者的肠道微生物进行功能探索，发现肠道功能活性微生物的主要菌种的功能主要包括了碳水化合物代谢、能量转换及细胞组分的合成。这些研究都表明了肠道微生物是人体代谢的重要参与者。

(二)对人体生理功能的调控

人体微生物是人体代谢的重要参与者，不但能为人体的代谢提供底物、酶和能量，还参与维生素的合成[22]、将难消化的食物成分发酵成可吸收的代谢物、去除有毒化合物，其产生的代谢物还能促进人上皮细胞的生长和分化。微生物代谢物，如短链脂肪酸除了为人提供能源外，还能促进血管舒张和肠道蠕动、帮助上皮组织伤口愈合、作用于中性粒细胞等抑制炎症的产生[23]，或作用于分泌细胞来增加胰岛素的分泌。微生物的代谢物还能间接影响大脑的认知功能[24，25]。研究人员在小鼠中的研究发现肠道微生物与先天免疫系统的相互作用是影响I型糖尿病的发生的关键表观遗传因素[26]；肠道微生物还可以改变胆汁酸在人体的循环过程，调节脂肪和葡萄糖代谢，影响人体血清代谢组和胰岛素敏感性[27]，影响II型糖尿病的发病。

(三)对人体免疫能力的作用

人们的免疫系统能识别和消灭外来病原菌，但却允许体内共生微生物的存在。微生物在与人体共同进化的几百万年时间里已经与人体的免疫系统形成了密切关系，能通过对有限营养物质的直接竞争和宿主免疫反应的调节等机制保护人体免受外来病原体和潜在有害的体内微生物的定殖[28]。MBL缺乏的慢性阻塞性肺病患者的肺微生物群多样化程度高，更不容易被嗜血杆菌定植，气道炎症水平较低[29]。肠道微生物与肠黏膜免疫系统的形成有关。研究表明，婴儿早期共生微生物定殖能促进上皮内淋巴T细胞的发育[30]，微生物菌群结构失调可能会导致免疫系统异常[31-33]，增加患食物过敏、肠道炎症性疾病(IBD)、类风湿关节炎或I型糖尿病的风险。

四、人体微生物组的应用

(一)人体微生物群落重建

大量的研究表明，肠炎症性疾病患者肠道微生物群与健康个体相比发生了显著变化。人们通过对人体微生物组及功能的研究和临床试验发现，特定的细菌能影响宿主多种代谢通路的发育，包括炎症和抗炎反应。不同的共生微生物定殖会影响宿主患感染或自身免疫病的可能，共生微生物种群组成对维持宿主健康状态很重要，一些共生菌群有防止炎性肠病的作用[31，34]。寻找合适的共生微生物组合，帮助它们在人身上进行定植是治疗某些目前无法治愈的多种疾病的新思路。通过确定在宿主出生时定植的共生菌组合，可以提高宿主早期抗感染的能力并可以防止自身免疫病的发生[35]。

(二)开发以肠道菌群为靶点的医药、食品及保健品

中医有以粪便入药的作法，2015年Xu等人通过随机双盲及安慰剂对照的临床试验证实“葛根芩连汤”对糖尿病有显著疗效，并提供分子水平的证据证明该中药可能是通过调整菌群结构发挥药效[36]。从人体微生物组定殖规律的研究中不难发现，人们微生物组的结构与寄主代谢密切相关。人的年龄、生活和饮食习惯[37]、健康状态、遗传因素、情绪状态及是否接受抗菌治疗都会对共生的微生物群落产生影响，微生物群落结构又影响宿主健康状态。微生物与宿主间存在相互作用关系[23，38，39]，虽然微生物之间以及微生物与人体之间的许多相互作用关系还不明确，但是基于目前研究，人们发现菌群的构成和代谢可被饮食调控，科学和临床实验有大量证据表明，一些益生菌[40]、益生元和合生元对人体健康有很大作用。一种被称为VSL3的多益生菌制剂具有治疗结肠炎的效果。益生元是一种食品级的非生物材料，能促进人体内益生菌的增殖。在一种toll样受体7依赖的系统性红斑狼疮小鼠模型上的实验表明，饮食抗性淀粉可以改善由罗伊乳杆菌引起的自身免疫病[41]。一项针对Prader-Willi综合症(PWS)和单纯性肥胖儿童的住院干预实验中，富含非消化性碳水化合物的饮食可显著减轻体重并伴随肠道菌群结构的改变，同时减轻炎症[20]。花青素malvidin 3-葡萄糖苷可以通过调节结肠上皮细胞完整性、肠道微生物群以及主要炎症介质而改善肠道炎症。合生元是益生菌和益生元的组合，Furrie等人对18名溃疡性结肠炎患者进行为期1个月的联合使用益生菌，和益生元治疗溃疡性结肠炎的随机双盲对照试验，证明合生元的使用减轻了炎症，健康的上皮组织再生明显[42]。

五、讨论和展望

人体微生物组对共生菌群的分析使疾病模式能够紧密地与特定微生物或微生物群相联系。我们可以通过对微生物的调控来影响机体生理和免疫状态，从而对疾病进行有效治疗，改善人类健康，延长人类寿命。例如，基于利用微生物组的癌症免疫疗法[43]。近年来，大规模的宏基因组、宏转录组、宏代谢组学研究提供了人体微生物组结构和功能的信息，但对人体生理代谢重要的微生物功能基因在很大程度上尚未被揭示。就像Lynch等人在一篇综述中提到的，目前许多工作集中在探索微生物菌群与疾病的因果关系以及由微生物介导的疾病的致病机理[44]。如何利用大量的组学方法获得的数据集提出功能性微生物组的合理假设，还需要开发并合理使用实验模型观察研究潜在功能基因所产生的效应，促进功能微生物基因的发现。我们在对特殊部位微生物组进行调节时，应发展相应的微扰方法避免影响关键的生物学功能。另外，在小鼠上进行的一项有关可溶性膳食纤维的研究结果表明，在肠道微生物生态失调时进补这种传统意义上的益生元会增加肝癌风险，提示人们尝试将微生物组研究知识和成果应用于实践的过程中应谨慎操作[45]。