脊柱化脓性感染动物模型的建立及应用进展

李江笔 王永杰 那士博 吴宏 刘军 纪雪 公伟权 刘理迪 吕振山 张绍昆

手术部位感染是脊柱手术后常见且非常严重的并发症，严重影响患者的身体健康。尽管手术操作无菌细致，及时给予适当的全身抗生素，但手术部位感染率仍然很 高[1-2]。据报道，我国脊柱手术感染的风险从 0.5%～7.8% 不等[3-4]。糖尿病、肥胖、高血压等疾病显著增加脊柱术后感染，感染后治疗的费用可达 10 多万美元[5]，大大增加了患者的经济负担。脊柱手术部位的感染菌主要是金黄色葡萄球菌，其次是表皮葡萄球菌[6]，而 30%～50% 的金黄色葡萄球菌感染是由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 ( methicillinresistant staphylococcus aureus，MRSA ) 引起的[7]，大部分脊柱手术部位的感染是脊柱深部的感染，而且往往是术后早期发生感染[8]。一个良好的动物模型，将为研究脊柱感染的病理发展过程以及药物的治疗效果评估提供帮助。笔者对现有的脊柱术后感染的动物模型进行概述，为广大科研工作者选用脊柱化脓性感染动物模型提供指导。

一、兔模型

1. 兔部分椎板切除感染模型：2000 年，Poelstra 等[9]发表了一个兔脊柱术后感染模型，此模型是用咬骨钳模仿部分椎板切除术切除棘突，在 T13、L3和 L6椎体横突植入克氏针，T13和 L6接种 100 μl 不同菌浓度的 MRSA，L3接种生理盐水作为对照。接种后 1 周收集手术部位的克氏针及周围组织做细菌计数评估感染程度。根据细菌计数结果，所有接种了至少 103CFU MRSA 的部位都发生了感染。Stall 等[10]的研究显示，接种 106CFU MRSA 能够产生 70% 的感染率，Sweet 等[11]的实验表明接种 107CFU MRSA 感染率为 100%。因此，在选用此模型造模时，接种的 MRSA 的量可以达到 107CFU。脊柱手术中植入金属装置导致术后感染明显增加，是由于细菌在金属表面形成生物膜，导致细菌对抗生素的耐药性增加。在此之前，很少有脊柱金属植入感染模型。此模型手术操作在兔子脊柱后方进行，能避开大的血管和神经，操作相对简单安全，能较好地模拟临床脊柱金属植入手术部位的感染。3 个手术部位相互独立，避免了手术创口交叉感染，无全身系统性感染说明手术部位的感染是由于细菌接种导致，每只兔子可以细菌接种 2 个部位，减少了实验兔子的数量。此模型用途广泛，可以用来评估不同植入物对脊柱手术感染的影响，以及通过腹腔注射或局部放置药物的方式评估不同治疗方式对脊柱感染的治疗效果。也可以用相同的造模方式来建立其它细菌脊柱感染的动物模型。但也存在感染评估方式比较单一的问题。缺乏病理染色等其它重要的检测手段。2 个手术部位接种细菌与只接种 1 个手术部位的宿主反应是否相同还有待商榷。Laratta 等[12]在此模型的基础上做了一些改进，在 T4、L1、L6上接种大肠埃希菌，在 T9上接种生理盐水作为空白对照，进一步减少了兔子数量，接种 105CFU 大肠埃希菌可造成软组织和植入物的感染，此模型可以用来指导脊柱革兰阴性菌如大肠埃希菌的抗感染治疗。

此模型在药物预防脊柱感染实验中得到广泛应用。Laratta 等[13]用此模型评估了局部应用万古霉素粉在脊柱植入手术后预防手术部位感染的能力，研究结果表明手术中使用万古霉素粉有助于降低手术部位感染的风险。Liu 等[14]用聚乳酸-乙交酯微球搭载万古霉素，然后使用此模型评估这种缓慢释放万古霉素的微球在手术部位抗感染的作用。而 Stall 等[10]是通过静脉注射庆大霉素微球的方式，用此模型研究此药物对手术部位金黄色葡萄球菌的杀菌作用。

2. 兔椎间盘感染模型：Guiboux 等[15]于 1998 年报道了一种家兔椎间盘感染模型，通过手术暴露 L3～4、L4～5、L5～6椎间盘，直视下用注射器将金黄色葡萄球菌液注射到椎间盘，术前或术后静脉注射头孢唑林或万古霉素，手术后 5 天，收集椎间盘进行细菌培养。实验得出术前 1 h 内静脉注射头孢唑林或万古霉素可有效预防术后椎间盘炎的结论，术后补充抗生素无明显优势。此模型重复性好，在模拟手术技术方面准确性高。不幸的是，实验的结果与真实患者的情况不一致，因为尽管术前使用抗生素，大量患者也会发生术后感染。该模型的结果和实际患者的情况之间的差异可能归因于实验样本量小，并且可能是本研究中使用的培养技术灵敏度低。实验感染评估的方式单一，可以增加多个时间点评估感染以及对感染严重程度进行量化。利奈唑胺由于副作用小，抗菌作用强，是一种很具有临床吸引力的抗生素。Conaughty 等[16]应用此模型比较利奈唑胺和万古霉素治疗 MRSA 椎间盘炎效果强弱，发现万古霉素优于利奈唑胺。Bierry 等[17]对此模型做了一些改进，透视下，经皮从后外侧入路，用穿刺针将 103CFU 金黄色葡萄球菌注射到 L3～4和 L5～6椎间盘。通过 MRI、HE 染色以及组织细菌计数来诊断椎间盘是否感染，并评估椎间盘感染的程度。结果发现所有兔子的椎间盘都发生感染，增强 MRI 可以更早、更精确地确定感染的存在和程度。其检测手段丰富，但操作相对困难。

3. 兔椎间盘切除感染模型：此模型是由李晶等[18]报道，是经前外侧腹膜后入路，暴露出兔脊柱 L1～2、L5～6椎间盘，切除椎间盘并刮除上下软骨终板。然后将 0.1 ml 金黄色葡萄球菌悬液接种于吸收性明胶海绵上，将吸收性明胶海绵放置于椎间隙，骨蜡封闭，术中术后不使用抗生素。术后 2 周行脊柱 X 线和 CT 检查，抽取静脉血进行细菌培养，兔子处死后取肝脏及手术部位上下邻椎体骨组织，行组织病理学检查及细菌培养。结果显示 102CFU / ml 的金黄色葡萄球菌悬液可以稳定地诱导出脊柱化脓性感染，经影像学和组织学检查证实接种椎间隙上下位椎体骨组织发生典型化脓性骨髓炎的病理改变。此模型感染评估方式丰富，可以对感染严重程度进行量化，但手术操作难度大。李晶等用此模型研究纳米银局部给药治疗脊柱化脓性感染的疗效，以及局部给药后纳米银在动物体内的生物学分布。结果显示纳米银局部连续给药能有效预防和治疗脊柱的化脓性感染，但在动物体内会产生蓄积作用，并且与给药浓度相关。

二、大鼠脊柱感染模型

1. 大鼠椎弓根螺钉感染模型：Ofluoglu 等[19]建立了大鼠椎弓根螺钉金黄色葡萄球菌感染模型。在胸腰段中线区域 ( T10～L1) 划 1.5 cm 皮肤切口，分离椎旁肌，暴露小关节。用手术刀剥去椎板，用针头在椎板和关节突关节连接处钻孔，然后置入钛螺钉。将不同浓度的金黄色葡萄球菌放置在螺钉和周围组织上，缝合关闭组织。术后 15 天，将螺钉、周围组织取下，进行微生物学和组织病理学评估。结果表明当接种 106CFU 金黄色葡萄球菌时有急性骨髓炎的表现，组织病理学评估发现有骨坏死和中性粒细胞浸润。因此，在脊柱感染大鼠模型中，金黄色葡萄球菌的最佳接种量为 1×106CFU。此造模手术技术与临床椎弓根螺钉植入技术极为相似，而且实验可重复性高，除了组织细菌计数评估感染外，还使用组织病理学染色。缺点是大鼠个体小，手术操作困难，需要在手术显微镜操作，设备要求高；其次此模型没有评估生物膜的形成。

蜂王浆被发现会抑制 MRSA 的生长，Gunaldi 等[20]用此模型评估蜂王浆对大鼠脊柱植入性感染是否有预防作用。实验结果表明，蜂王浆不能完全预防 MRSA 感染，但能明显减轻感染的严重程度。Ozer 等[21]探讨达托霉素和万古霉素对实验性脊柱植入性感染的预防作用，结果显示万古霉素对半数动物 ( 50.0% ) 手术部位感染有抑制作用，而达托霉素对更多动物 ( 71.4% ) 有抑制作用。目前，用药物载体搭载抗生素局部治疗感染是一种非常有前景的治疗方式，在植入脊柱相关感染的治疗上，全身治疗通常是不够的，局部治疗有一定的优势。Ofluoglu 等[22]用聚甲基丙烯酸甲酯棒搭载万古霉素局部应用治疗脊柱植入物感染，发现局部应用万古霉素比静脉注射万古霉素抗感染治疗效果好。

2. 其它大鼠化脓性感染模型：Sweet 等[23]于 2018 年报道了大鼠椎板切除感染模型。通过胸椎正中线划 1.5 cm 切口，分离椎旁肌肉组织，暴露棘突，模仿椎板切除术切除部分椎板，将环形血管移植物放入与棘突相邻的肌肉下位置，然后将 200 μl 108CFU / ml 甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌 ( methicillin-sensitive staphylococcus aureus，MSSA ) 放入到创口。等菌液渗透到血管移植物和周围组织后，实验组再局部放置万古霉素粉末或妥布霉素粉末，对照组术前静脉注射抗生素。7 天后处死老鼠，将环形血管移植物取出，放入血平板上培养，观察是否有金黄色葡萄球菌生长。结果显示万古霉素和妥布霉素粉局部应用能有效预防感染，优于全身静脉注射抗生素。

Bostian 等[24]建立了大鼠尾椎椎间盘感染模型。先确认大鼠尾部最近端 3 个椎间盘，用注射器向第 3 个椎间盘内注入 100 μl PBS 溶液，向第 1 个椎间盘内注入 100 μl 不同浓度的生物荧光金黄色葡萄球菌菌液，然后对大鼠进行 6 周的生物发光成像，观察金黄色葡萄球菌在大鼠体内的分布，通过影像学和组织病理学评估尾椎的病理改变， 结果表明，在大鼠尾椎间盘内注射生物荧光金黄色葡萄球菌是一种可行的研究椎间盘炎的动物模型。该模型使用生物荧光成像技术，能够实时对体内感染的强度进行量化，也能减少椎间盘感染研究所需的动物数量，而且手术操作简单。

李强[25]建立了大鼠脊柱后路手术感染模型，用此模型评估纳米银凝胶防治脊柱后路手术后感染的效果及安全性。选择腰部后正中入路，L4～6部位手术，显露并切开 L5椎板，撕裂相对应的硬脊膜，放置生物荧光金黄色葡萄球菌菌液和克氏针，然后放入纳米银凝胶预防脊柱感染，或感染后行清创治疗，放入纳米银凝胶治疗脊柱感染，结果表明纳米银凝胶能有效预防和治疗脊柱后路手术后感染。

三、小鼠脊柱感染模型

Dworsky 等[26]报道了小鼠脊柱植入感染模型。此模型是先用针头在 L4棘突横向穿一个孔，然后沿针孔将 L 形克氏针短臂植入棘突，长臂沿脊柱放置。向创口接种 200 μl 不同浓度的生物荧光金黄色葡萄球菌菌液。对小鼠进行 35 天的生物发光成像，观察小鼠体内金黄色葡萄球菌的分布，35 天后收集克氏针及周围组织做细菌计数评估感染。结果显示至少接种 103CFU 金黄色葡萄球菌的小鼠，可以诱导出稳定的脊柱化脓性感染。此外，还能对中性粒细胞浸润进行实时监测，从而实现对细菌感染的强度和炎症反应进行定量。

Hu 等[27]用此模型比较万古霉素联合利福平治疗脊柱化脓性感染的效果差异。感染后 7 天，给予抗生素治疗，生物发光成像显示，抗生素应用后，小鼠体内细菌快速减少，感染后 14 天停止抗生素治疗，细菌数量又开始增加。虽然这两种抗生素最初都是有效的，但它们不能完全消除细菌感染，抗生素停止后会发生感染反弹。这个模型第一次说明，基于组织学抗菌药物的静态评估可能会产生误导，长时间追踪感染就显得尤为重要。

此模型还用于研究核素荧光成像探针诊断金黄色葡萄球菌[28]。目前的 CT、MRI 等成像模式虽然能够检测解剖学改变和异常，但不能区分感染和无菌性改变，以及诊断特定的病原体。核素荧光探针能够特异性识别金黄色葡萄球菌，并且能够体外荧光成像，这样探针就能准确诊断出急性和亚急性种植体感染，而且荧光图像可以指导选择性清创感染组织。

四、犬脊柱感染模型

Chen 等[29]报道了犬椎间盘感染模型。手术暴露犬脊柱 T12～L1椎间隙，椎间盘部分切除，用刮匙破坏椎间隙相邻的上下椎体终板，然后将含有不同浓度的金黄色葡萄球菌液和硬化剂鱼肝油酸钠注射入犬的脊柱椎间隙，构建急性化脓性椎间盘炎模型。术后通过微生物学、影像学和组织病理学对感染的程度进行评估。此模型与兔子椎间盘切除感染模型类似，感染评估方式丰富，缺点是犬个体大，手术操作难度大，未能长时间跟踪感染。脊柱化脓性感染最常受累的部位是腰椎，椎间盘是常累及的部位[30]，此模型更接近人体脊柱化脓性感染。在使用内固定的手术中，理论上讲，内固定物会对周围软组织产生刺激，从而产生炎症以及血肿，最终促使致病微生物的生长[31]。此模型中使用的鱼肝油酸是一种硬化剂，它可以阻止病菌通过血行传播，而使感染局限化，一直被广泛应用于实验性局部感染的诱导[33-34]。陆健等[32]应用生物发光基因标记细菌建立动物感染模型，探讨前路一期清创自体髂骨植骨钛板内固定治疗脊柱化脓性感染的可行性及安全性，证实体内假体上细菌附着是一种相对的普遍现象，并且内固定后取出的假体上分离出来的细菌与内固定前脊柱所感染的细菌种类并非同源，提示前路一期清创自体髂骨植骨钛板内固定治疗脊柱化脓性感染是安全有效的，内固定的使用不会造成感染复发或持续性慢性感染。

五、猪脊柱感染模型

猪脊柱既是模拟人类脊柱手术良好的生物力学模型，也是模拟人类脊柱感染过程优良的动物模型[35-36]。脊柱内固定术后感染仍然是一个棘手的并发症，具有潜在的破坏性后果[37]，移除感染的器械有可能破坏脊柱稳定性，而保留器械则增加复发感染的风险[38]。Singh 等[39]应用猪脊柱感染模型，评估负压伤口治疗联合抗菌滴注对猪脊柱植入物感染和生物膜形成抑制作用效果，同时与传统治疗方式做比较。将钛棒植入猪脊柱棘突，接种 106CFU MRSA。术后 1 周，实验组接受负压伤口治疗联合抗菌滴注，对照组接受湿-干敷料治疗。通过组织细菌培养评估局部感染情况，使用扫描电子显微镜观察脊柱植入物上的生物膜形成。负压创面疗法是将带有多侧孔引流管的特殊敷料填充于引流部位，通过负压吸引装置持续或间断地引流创面坏死组织或渗液[40]。结果表明，对于猪脊柱植入物感染，与传统湿-干敷料治疗相比，负压伤口治疗联合抗菌滴注与细菌负荷和生物膜形成减少有关。猪脊柱结构更接近人，此模型更接近人体脊柱化脓性感染，缺点是猪个体大，成本高，操作难度大。

六、小结

人类脊柱感染疾病的发展十分复杂，以人本身作为试验对象来深入探讨该疾病发生机制发展缓慢，临床积累的经验不仅在时间和空间上都存在局限性，而且许多试验在道义上和方法上也受到限制。借助于动物模型的间接研究，可以有意识地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素，以便更准确地观察脊柱感染模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究，有助于更方便、更有效地认识人类脊柱感染的发生发展规律，研究防治措施。现有各种脊柱化脓性感染模型各有优缺点，Poelstra、Ofluoglu 等的模型可重复性高，能精确模拟临床手术技术。然而，这些模型中使用的检测方法的敏感性仍存在问题，仅依靠简单的细菌培养方法和组织学分析来评估一个时间点的感染，未能长时间实时观察感染的过程。小鼠模型荧光成像技术的应用，则有效解决了这个问题，生物发光菌株可以提供一种可视化感染的方法，小鼠是更经济有效的动物。未来的模型将会应用微生物学、影像学和组织病理学，联合荧光成像等技术对感染进行充分评估。