电针干预基因修饰神经干细胞移植调控 Notch 通路重建神经环路研究进展

杨艺 谭龙旺 张勇

脊髓损伤 ( spinal cord injury，SCI ) 严重复杂，甚至危及生命，不但远期预后差，且致残率高[1-3]。在病理上可划分为原发性损伤和继发性损伤两个阶段[4]。最先出现脊髓组织和结构被破坏，继而伤区发生缺血、缺氧、炎性反应、细胞凋亡等一系列变化，致使神经元变性坏死、神经胶质细胞修复功能被抑制、轴突慢性脱髓鞘，最终导致神经功能障碍。笔者通过查阅大量文献，结合目前 SCI 的病理机制，发现可以从基因修饰神经干细胞移植、Notch 信号通路和电针这三个方面开展研究，为 SCI 后神经环路的重建提供思路。现对以上三个方面进行详细综述。

一、基因修饰神经干细胞移植

1. 神经干细胞的来源：神经干细胞属于未分化的神经祖细胞，可分化为具不同功能的各类型细胞如神经元等，SCI 后其能通过自我更新、复制进而形成神经组织[5-7]。1992 年研究者首次从大鼠脑组织纹状体中分离出神经干细胞[8]，随后相继于脑室周、齿状回及海马等部位发现神经干细胞[9]。目前认为，成年哺乳动物的脑室下区和海马齿状回颗粒下层是神经干细胞的获取部位[10]。

2. 神经干细胞的特点：神经干细胞具有定向迁移、组织融合、免疫豁免性及多能性，且经多次传代后其基本特性保持不变，较易获得、培养和增殖，移植入机体后能保持长期存活，对其研究具有不受伦理学问题困扰等优势[11]。神经干细胞在含血清的培养基中通过球形悬浮生长和贴壁生长两种方式逐渐伸展，进而形成轴突或树突样连接，最终分化为成熟神经元和神经胶质细胞[12]。神经干细胞表达的特征在于 CD133+、CD34-、CD45-的出现[13]，尤其是神经元中间丝蛋白-神经巢蛋白 ( nestin ) 的表达，但 nestin 出现时间较短，在有丝分裂后期即前体细胞分化成神经元或胶质细胞时，其表达量便开始逐渐减少，神经丝和胶质纤维酸性蛋白等特异性中间纤维的大量出现最终将其取代[14]。神经干细胞未分化的这一自身特点决定了其具有免疫豁免性，表现为神经干细胞不表达细胞抗原，因此将其移植入机体后免疫排斥的发生率大大降低。神经干细胞还具有多能性，表现为它们分化的子细胞可以依据机体的需求，通过对称分裂或不对称分裂分化出神经系统所需的各种类型细胞。两种分裂方式的区别在于，不对称分裂必定生成干细胞和前体细胞，而对称分裂由于产生的细胞类型相同可能出现无干细胞生成或无前体细胞生成的结果[14]。

3. 神经干细胞的移植途径：SCI 后的前 7 天为急性期，机体会产生一系列炎性反应，至 41 天后逐渐转为慢性期，此时纤维瘢痕已经形成，若神经干细胞于此两阶段移植入机体则均无成活可能。相反，在 8～41 天即亚急性期时，急性期表现的炎症逐渐消退，毒性代谢产物和氧自由基减少，微环境得以改善的同时纤维瘢痕尚未形成，相对适合神经干细胞存活、生长，故此阶段最适宜将神经干细胞移植入机体。目前主要有局部注射、经脑脊液注射、经血液循环注射三种神经干细胞移植途径[15]，但何种移植途径最安全且有效尚无统一定论。局部注射移植通过立体定向将特定剂量神经干细胞直接注射入病损脑区或脊髓周围区域[16]，建立了新的突触结构[17]，在替代凋亡的神经细胞的基础上预防了脊髓空洞症的发生。经脑脊液途径移植是基于干细胞归巢性和脑脊液循环理论将外源性干细胞注射入脑室、脑池。例如基于脑脊液循环理论可在腰椎穿刺时将神经干细胞直接注射入蛛网膜下腔，使神经干细胞通过脑脊液循环间接到达病损脑区。此移植途径还包括利用脑室穿刺和枕大池穿刺的方法，但多见于基础研究，临床应用较少报道[18]。经外周血液移植包括静脉移植和动脉移植，静脉移植是应用最早的移植方式，但操作时对细胞需求量大，且靶向疗效较差[19]。动物实验研究表明，神经干细胞通过动脉移植较静脉能在更短的时间内迁移至伤区替代凋亡的神经细胞[20]，显著降低了神经干细胞的失活量和死亡率。

4. 基因修饰神经干细胞移植治疗 SCI 的机制：神经干细胞有效到达伤区后开始更新、复制，并在局部微环境作用下诱导微血管再生，促使细胞定向分化为神经前体细胞，释放生长因子，建立新的轴突连接，修复损伤、坏死的神经元。此外进一步研究发现，利用生长因子对神经干细胞加以修饰后再移植到伤区，其生物效用将远高于单一的细胞替代或基因治疗。生长因子基因治疗是采用基因转染技术，通过为中枢神经系统生长提供一个适宜的微环境而促进其再生[21]。目前主要研究构建神经营养因子 ( neurotrophic factors，NTFs ) 基因载体，通过基因转染神经干细胞，再将其移植于脊髓伤区，使之持续表达并充分发挥 NTFs 的生物学活性，进而促进神经再生。NTFs 分两大类，以神经生长因子 ( nerve growth factor，NGF ) 为主的神经营养素家族和睫状 NTFs 等生长因子，后者主要包括碱性成纤维细胞生长因子 ( basic fibroblast growth factor，bFGF ) 和血管内皮生长因子 ( vascular endothelial growth factor，VEGF ) 等。

bFGF 是 Hoftman 在 1940 年从脑和垂体的抽提物中发现的一种促细胞分裂、活性广泛的 NTFs 蛋白，不仅可以抑制神经元凋亡还能提高神经元成活率，促进轴突定向生长[22]。生理情况下 bFGF 在脊髓中表达水平低，一旦发生 SCI，则其呈高水平表达。表现在它可以抑制脊髓神经元 c-fosm RNA 的活性进而促进少突胶质细胞和神经元生长；可以促进损伤皮质周围区域的星形胶质细胞增殖[23]，上调内皮细胞 β1 整合素表达以增强内皮细胞的黏附、识别和迁移以诱导新生血管形成；加快神经干细胞向少突胶质祖细胞分化进而增加白质和皮质中少突胶质细胞的数 量[24]；抑制谷氨酸盐的细胞毒性以保护神经功能[25]；稳定 Ca2+稳态，拮抗缺氧、兴奋性氨基酸、自由基等的损害，以改善脊髓水肿局部微环境而保护神经元。

VEGF 是具有高度特异性的生长因子，主要由 7 个内含子和 8 个外显子组成，包括 VEGF-A、VEGF-C 和 VEGF-E 等，可以促血管内皮细胞生长增殖、迁移，能够对血管通透性起到诱导效应[26]。在 SCI 后局部低氧微环境条件下，VEGF 与内皮细胞膜上的受体相结合，使 VEGF 受体自身磷酸化并激活活化激酶，促进有丝分裂，使血管内皮细胞的血管得以再生[27]。已有研究表明，VEGF mRNA 的表达水平愈高，新生的血管数量愈多[28]。VEGF 通过调控血管的通透性及细胞的分化、迁移和增殖，有效改善了 SCI 局部微循环障碍，直接抑制了神经细胞凋 亡[29]，由此进一步加快了神经功能的恢复。

二、Notch 信号通路

1. Notch 信号通路的基本结构：Notch 信号通路在动物体内广泛存在，在体内各细胞间转导、传递各种信号，但表现有保守的特点，参与各细胞的整个生命阶段，还涉及神经干细胞的增殖和分化。Lassiter 等[30]研究发现，小鼠 SCI 后敲除小鼠的 Notch1 受体、RBP-j 基因、γ- 分泌酶抑制剂 DAPT 甚或配体 Delta 造成 Notch 信号转导发生障碍时，小鼠体内的神经元可较快得到修复；而当 Notch 信号无障碍转导时，则出现相反的结果。Notch 信号通路主要由三大部分组成，分别为 Notch 受体、Notch 配体和 CSL [ CBF1 ( C promoter Binding Factor-1 ) / Su ( H ) ( Suppr essor of Hairless ) / LAG-1 ]-DNA 结合蛋白[31]。

Notch 受体在本质上属于跨越脂双层的膜整合蛋白，其肽链长度约 300 kD，分为高度保守的细胞内、外区域和贯穿生物膜两端的跨膜片段，是决定细胞命运的核心部分。其中，胞外部分存在基因序列的多拷贝现象，如表皮生长因子 ( epidermal growth factor，EGF ) 样基因富含半胱氨酸的 Notch / Lin-12。Notch 的跨膜受体是类表皮生长因子域 7 ( epitcrmis-like growth factor domain 7，EGFL7 ) 结合分子，分泌性 EGFL7 可以识别 Notch 的某个区域，并在配体的信号作用下拮抗 Notch 信号。在哺乳动物体内 Notch 受体存在 Notch1、Notch2、Notch3 和 Notch4 共 4 个同源基因，其各亚型的 EGF 样重复序列和胞内域的长度是不同的。Tatsumi 等[32]研究证实了 Notch1 受体存在于大脑皮层表面到髓质这 6 个层次中，可以触发 Notch 信号通路的转导从而参与神经系统的功能发挥。

Notch 配体也称 DSL ( Delta / serrate / LAG22 ) 蛋白，含有 Delta 样和 Serrate 样配体，分别为 Delta-1、Delta-3、Delta-4 以及 Jagged-1 和 Jagged-2，它们都以短单向跨膜蛋白的形式存在于胞浆区。细胞外区域为不同 EGF 样基因序列的多拷贝和保守的半胱氨酸含量较高的 N 端 DSL 片段[33]，后者是结合 Notch 受体实现活化的必需基序，是 Notch 受体相互作用的关键所在。

CSL 蛋白家族成员可以在结构上联系 Notch 细胞内结构域 ( notch intracellular domain，NICD ) 的锚蛋白 ( Ank ) 序列形成复合物，同时结合核内的 CSL 以激活 CSL 相关下游目的基因。Notch 主要的下游目的基因如 Hes-1、Hes-5 等主要编码碱性螺旋-环-螺旋 ( basic helix-loop-helix，bHLH ) 转录调节因子家族如 Mash1、NeuroD、Neurogenins 等抑制调节因子。CSL 中的 CBF-1 蛋白是 Notch 信号迄今为止惟一已知的转录因子，其又称为 RBP-j[34-35]，可以活化与 E ( spl ) 属共同始祖分子在序列或结构上相似的 Hes1 /5，阻断神经干细胞的分化。

2. Notch 信号通路的激活及转录机制：CBF-1 / RBP-j 依赖途径是激活 Notch 信号通路的经典途径。旁细胞的 Notch 配体与受体特异性结合后触发 Notch 信号，随后 Notch 蛋白历经三次剪切释放 NICD 于胞质，继之 NICD 入细胞核并结合转录因子 RBP-j 形成 NICD / RBP-j 转录激活复合体，最后启动 bHLH 转录抑制因子家族的靶基因实现 Notch 信号通路的活化与 mRNA 的合成。具体过程为：Notch 受体蛋白与配体在核糖体内相互识别形成需翻译后加工的新的 Notch 受体多肽链，在蛋白质前体转化酶类 furin 蛋白酶的作用下，于物流中心高尔基复合体的反面网状结构内切割 S1 位点将多肽链水解为三部分，分别为 NICD、胞外的 N-末端片和跨膜的 C-末端片，三部分两两以非共价键结合成 Notch 异源二聚体表达于细胞表面。继之 Notch 受体与配体在胞外区相互识别后启动金属蛋白酶家族的肿瘤因子 α-转换酶 ( TNF-α-convertingenzyme，TACE )，被 TACE 于 S2 位点裂解为 2 个肽链，N 端肽链 ( ECN ) 被配体介导的细胞吞并，C 端产物被 γ-分泌酶 ( γ-Secretase ) 于 S3 位点水解，被剪接下的 NICD 从质膜转位至细胞核，由此改变了贯穿生物膜两端的跨膜片段和细胞内区域的构象。NICD 中的 RAM 域存在一个可与 RBP-j 高度亲和的位点，而 Ank 则与 RBP-j 形成弱联系，并在转录激活因子如组蛋白乙酰转移酶 p300 等作用下形成转录激活复合体，启动 bHLH 基因家族，诱发 Notch 信号。其中，γ-分泌酶是 C 端产物在 S3 位点水解的必须因素，早老素 ( presenilin，ps ) 1 是其实现催化作用的部位。

bHLH 是激活 Notch 信号通路的直接目的基因，分为发挥抑制效应的 Hes1、Hes3 和 Hes5 等以及发挥促进效应的 math、mash1 / hash、ngn 等。其中 mash1 与 bHLH 转录因子活性剂 E47 作用形成糖基化肽链加速神经干细胞特化为神经元。Hes 作为 mash1 的上游基因，其中的 Hes1 通过与启动子部位结合抑制 mash1 的表达和活性。因此，Hes1 实为 Notch 信号激活的最关键感受器，通过抑制 Hes1 阻断 Notch 信号通路，实现 mash1 高表达，最终促进神经再生。

三、电针调节 SCI 后的局部微环境变化

SCI 在祖国医学上称之为“痿证”“体堕”等，且根据经络循行理论认为其本质为督脉受损，施治当以活血化瘀、通调督脉为则[36]。对 SCI 的病理机制目前有待进一步探究，但已明确的机制包括氧化应激、炎性反应和微循环障碍等[37-38]，在 SCI 早期尽快予以相关治疗不仅能减轻继发性损伤，而且对患者远期预后的改善具有重要意义[39]。研究表明，炎性反应在 SCI 的病理机制中起核心作用，是诱导继发性损伤的主要原因[40]。炎性环境使伤区大量胶质细胞聚集，同时分泌大量的细胞外基质，导致瘢痕组织形成，严重阻碍了神经元再生及神经功能恢复。因此减轻 SCI 早期炎性反应是关键[41-42]。大量文献报道了针灸不仅对急性 SCI 有效，而且对慢性 SCI 同样有确切的疗效[43-45]。传统微针针刺联合低频直流电组成电针，可实现针刺激和电刺激双倍兴奋性效应，大量研究证明，电针具有改善 SCI 脊髓供血、抑制急性期炎性反应、加速炎性因子的代谢、减少神经细胞凋亡、减轻细胞受损、促进神经功能恢复以及局部镇痛等神经保护作用，对治疗 SCI 疗效确切[43-44,46-53]。

四、SCI 后电针干预基因修饰神经干细胞移植与 Notch 通路相互关系

SCI 后虽然伤区脊髓内的内源性神经干细胞开始迁移、增殖和分化，但大多数分化为星形胶质细胞形成瘢痕组织，极少分化为功能性神经元和少突胶质细胞参与对损伤脊髓的修复。干细胞是一类具有向多种成熟细胞特定分化潜能的祖细胞，故干细胞移植为 SCI 的治疗提供了新思路。其中的神经干细胞在向神经元、神经胶质细胞等定向分化的同时还具有免疫豁免等诸多自身优势，因此非常适宜用细胞替代疗法的种子细胞。但单一的细胞移植存在成活率低及向神经元定向分化的效率低等问题，为此，利用基因转染技术以 NTFs 等对神经干细胞加以修饰后再移植，在成活率和分化率提高的基础上[54]，又达到了细胞替代及基因治疗的双重生物效用。电针在改善 SCI 后局部微环境的同时还调控相应信号通路，参与神经干细胞的增殖和分化。其中 Notch 信号通路与细胞的生长、发育乃至凋亡均密切相关，涉及多种神经系统疾病，尤其在中枢神经系统中参与并调控神经干细胞的增殖和分化[55]。武鑫等[56]基于 Notch 信号通路研究电针干预对放射线照射小鼠神经干细胞增殖和分化的影响，结果显示，电针组与放射线照射组比较，电针组神经干细胞分化的功能神经元 ( BrdU / NeuN 免疫荧光染色的阳性细胞 ) 显著增加，Notch1 蛋白均显著减少，mash1 蛋白均显著增加，说明了电针通过调控 Notch1 和 mash1 的表达抑制了 Notch 信号通路，从而促进神经干细胞增殖并向功能神经元分化，实现对放射线照射损伤小鼠神经干细胞增殖分化的逆转。姚海江[57]在前期研究基础上，进一步证实了督脉电针通过调节 Notch 信号促进神经干细胞分化的机制，采用免疫组织化学和 Western Blot 方法检测大鼠局部 Delta-1、ps1、Hes1 以及 Hes5 的表达情况。结果显示，与空白对照组相比，不同时间点上述 4 个观察指标的表达量均明显降低，表明督脉电针通过抑制配体 Delta-1 的表达进而抑制剪接蛋白 ps1 的表达，从而抑制了 Notch 信号通路，减少了其下游基因 Hes1 和 Hes5 的表达。既有效促进了神经干细胞定向分化为神经元细胞和少突胶质细胞，同时还抑制了神经干细胞向星形胶质细胞过度分化。

五、总结

SCI 后神经环路的重建涉及轴突、树突、神经元等多个水平，主要是通过损伤神经的轴突残端芽生生殖并定向至相应目的细胞以形成新的突触联系，进而使神经环路得以建立，并逐渐恢复神经对目的细胞的支配能力。Notch 信号参与有丝分裂后神经元结构成熟的过程，表现为抑制 Notch 信号，细胞停止于有丝分裂的 S 期，轴突分支增加，神经发生增加。SCI 后 Notch 信号被激活，采用电针干预 Notch 信号通路，在改善局部微环境的同时进一步促进了基因修饰神经干细胞的增殖与分化。这虽然为 SCI 提供了治疗思路和治疗途径，鉴于电针对 Notch 信号通路的调控非常复杂，且基因修饰神经干细胞移植多见于动物实验基础研究层面，临床研究缺乏大数据研究支持，故需更进一步更加深入的研究为 SCI 的治疗提供理论依据支持。