子宫颈癌筛查方法的研究进展

卜相冉，王 炯

(长治医学院附属和济医院妇科，山西 长治 046011)

子宫颈癌是威胁全世界女性健康和生命的主要恶性肿瘤之一，发病率居女性恶性肿瘤的第四位，世界卫生组织统计,全球每年子宫颈癌新发病例52.9万,死亡病例约27万,其中90%以上来自发展中国家[1]。中国作为最大发展中国家，2015年新发病例10.64万例，占全世界的15.4%，死亡病例4.77万例[2]。在中国，15岁～44岁女性中子宫颈癌的发病率位居第二位，仅次于乳腺癌，死亡率位居第三位[3]。子宫颈癌的发生和人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)有着千丝万缕的联系，99.7%的子宫颈癌中可检测出HPV，自1995年国际癌症研究中心专题讨论会指出高危型持续感染是发生子宫颈癌的首要因素而且为始动因素[4]。然而，从感染HPV发展至宫颈鳞状上皮内病变进而发展为浸润癌一般会历时10年～20年，在这个漫长的过程中，90%以上的感染会被机体自身免疫清除[5]，不能被自体免疫清除的病毒，便可以通过现有的筛查方法识别有可能发展为浸润癌的癌前病变，并运用现有的医疗技术治疗宫颈高级别病变，从而避免或阻断其进一步发展为浸润癌，达到治愈子宫颈癌的目的。本文对目前常用和不常用的子宫颈癌的筛查方法进行综述，为临床选择恰当的筛查方法提供理论支持。

1 肉眼观察法

肉眼观察法包括醋酸染色法(VIA)和碘染色法(VIAI)。VIA和VILI法均用生理盐水棉球擦拭宫颈后将5%醋酸/5%碘液均匀地涂布于子宫颈表面，待1 min后在普通光源下观察子宫颈的变化。VIA法病变区域显示白色，根据白色病变的厚薄、边界、轮廓、是否有镶嵌及其消失的速度等做出初步诊断。结果可分为阴性、阳性和可疑癌。VILI法子宫颈上皮呈现棕褐色为正常，未着色呈现芥末黄色为病变。根据未着色的程度、表面形态、边界状况及与鳞柱交界的距离作出初步诊断。结果可分为阴性、阳性和可疑癌。

近年来，VIA技术日益完善，利用叶酸受体进行上皮组织染色成为该病的新型筛查方法，其通过特殊染色法，能够在病理学的检测报告出具前初步筛查出宫颈管内与宫颈表面的宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅱ级以上病变[6]。VIA和VILI法均用于子宫颈癌筛查，方法简捷、容易操作、检查费用经济、培训简单、即查即出结果，不需要等待，适合经济不发达、医疗资源匮乏的地区。有文献报道，通过视觉筛查有50%的子宫颈癌可以在早期阶段(Ⅰ～Ⅱa期)检测到。2007年，在印度开展的一项大样本随机对照试验研究证明在发展中国家可将VIA和VILI作为有效的子宫颈癌的筛查方法[7]。但其灵敏度和特异度较低，对子宫颈癌患者不能进行详细分期，后期治疗也就不能给予明确的指导，被逐渐优化的筛查方法所取代也是大势所趋。

2 细胞学检测法

细胞学检测方法包括巴氏细胞涂片法及改良后的薄层液基细胞学检查(TCT)、DNA倍体定量分析检测法。

2.1 巴氏细胞涂片法

1941年美国Papanicolaou提出巴氏细胞涂片和染色法(巴氏涂片)，此法是过去70多年来子宫颈癌筛查的主要手段，在降低子宫颈癌的发病率方面发挥了重要作用。具体操作过程：暴露子宫颈，将子宫颈刮板置于子宫颈外口，将子宫颈刮板轻轻旋转，将刮出物均匀涂布于玻片上，95%乙醇固定30分钟后行巴氏染色，观察玻片上染色情况，其诊断标准按照巴氏分类法，可分为五级，Ⅰ级：正常，为正常宫颈细胞涂片；Ⅱa级：炎症，细胞核增大，核染色质较粗，染色质分布尚均匀，属良性改变或炎症；Ⅱb级：个别细胞核异质明显，但不支持恶性；Ⅲ级：可疑癌，有核异质，核大深染，核形不规则或双核或性质不明细胞；Ⅳ级：高度可疑癌，细胞有恶性的特征，但涂片中恶性细胞较少；Ⅴ级：可确定为癌，细胞具有典型的多量癌细胞。但巴氏涂片法存在细胞堆积、杂质多、取不到病变细胞、图像质量差等因素，容易影响检查结果的判读，假阴性率较高，多个临床研究显示，巴氏涂片用于子宫颈癌筛查的敏感性仅有51%(30%～87%),特异性也较低，容易造成部分患者漏诊或误诊，影响医疗质量[8],加之传统的巴氏五级分类法已无法适应现代临床细胞学要求，已逐渐被新的筛查方法所取代。

2.2 薄层液基细胞学检查(TCT)法

2.2.1 方法 ①检查前，非经期、禁性生活72 h、无阴道冲洗及上药。②检查时，暴露子宫颈，用“细胞刷”置于子宫颈管内旋转数圈采集子宫颈管、子宫颈外口脱落细胞。③将子宫颈“细胞刷”贮存于装有保存液的标本瓶内，充分摇匀。④制作薄层液基细胞涂片，95%乙醇固定、染色。⑤显微镜下观察+计算机辅助阅片。

2.2.2 结果判断使用TBS(the Bethesda system)分类法进行描述性诊断 (1)未见上皮内病变细胞或恶性细胞(NILM)；(2)上皮细胞异常，包括鳞状上皮细胞异常、腺细胞异常和其他恶性肿瘤。鳞状上皮细胞异常有：①不典型鳞状细胞(atypical squamous cells，ASC)包括无明确诊断意义的不典型鳞状细胞(atypical squamous cell of undetermined significance，ASCUS)和不能排除高级别鳞状上皮内病变不典型鳞状细胞(atypical squamous cells-cannot exclude HIS，ASC-H)；②低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL)：与CIN Ⅰ术语符合；③高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL)：包括CINⅡ、CINⅢ和原位癌；④鳞状细胞癌：若能明确组织类型，按下述报告：角化型鳞癌，非角化型鳞癌，小细胞型鳞癌；腺细胞异常主要有下列情况：①不典型腺上皮细胞(AGC)：包括宫颈管细胞AGC和子宫内膜细胞AGC；②腺原位癌(AIS)；③腺癌：若可能，可判断来源于宫颈管、子宫内膜或子宫之外；其他恶性肿瘤包括原发于宫颈和子宫体的不常见肿瘤及转移癌。

该方法弥补了巴氏细胞学五分类法的不足，提高了涂片的质量及对子宫颈癌诊断的准确度，降低了假阴性率，但该方法获得的结果过分依赖于病理医师的经验及技术水平，主观性较强，导致结果误差较大，再者TCT仅能发现细胞核形态学已经发生改变的病变，不能有效的尽早地发现癌前病变[7]。

2.3 DNA倍体定量检查方法

检查前禁忌同上，取截石位,窥阴器暴露宫颈，用无菌棉球将宫颈口处的分泌物拭掉。将一次性宫颈刷沿患者的阴道送至其宫颈内，沿顺时针方向旋转宫颈刷5圈。缓慢从患者的阴道内取出宫颈刷，放入准备好的细胞保存液中。振荡盛装细胞保存液的瓶身，使宫颈刷头完全浸没在细胞保存液中。将盛装细胞标本的瓶身密封好后，立即将其送至检验室。对每张DNA染色片(FEULGEN染色)上所有细胞核均采用全自动细胞图像分析系统进行扫描(每张载玻片扫描5000个以上细胞核)，并测定细胞核积分光密度值(IOD)与核面积，分析DNA指数(DNAINDEX，DI)，自动完成细胞的分类和计数(根据不同细胞核所具有的不同特征参数)，将同一张载玻片上的100个正常的上皮细胞作为标准对照，DI值为被测细胞IOD跟正常细胞IOD的比值。诊断标准：以DNA指数(DI)为指标，正常者，DI值为1～2(2C～4C细胞)，一般以2C作为标准对照细胞，DI≥2.5为DNA异常倍体(≥5C细胞)细胞。细胞DNA倍体定量结果分析判断：①未见DNA异常倍体细胞；②可见少量DNA异常倍体细胞：检出1～2个异常倍体细胞；③可见DNA异常倍体细胞：≥3个异常倍体细胞。细胞中的DNA改变与肿瘤发生具有相关性，若异倍体细胞发生染色体数量或结构变化，则说明细胞出现早期恶变特征。这种筛查方法通过流式细胞仪测量脱落细胞的DNA含量，提供了细胞学中异常非整倍体细胞的定性信息和存在性。可作为细胞学筛查的一个有用参数，且具有良好的特异性和敏感性[9]。通过参数分析能够较早识别患者已经发生病变的细胞，就能给予早期治疗，从而提高子宫颈癌患者的生存率。DNA倍体定量分析对子宫颈癌的早期诊断是目前较理想的新技术，可明显提高敏感性，降低漏诊率，有利于子宫颈癌的早期诊断早期治疗[10]。

3 人乳头瘤病毒相关检测法

高危型HPV持续感染是子宫颈癌前病变及子宫颈癌的主要致病因素。HPV检测方法主要有：第二代杂交捕获(Hybridcapture2，HC2)、酶切信号放大法(Cervista)、HPV快速筛查法(care HPV)、实时荧光定量PCR法(Cobas 4800 HPV)、Aptima HPV E6/E7表达检测法。

3.1 第二代杂交捕获2代技术(HC2)

HC2是利用信号放大的酶标板技术和化学发光检测法的核酸杂交检测方法对13种高风险型HPV和5种低风险型HPV在分子水平进行定性和半定量检测法[11]。具体操作：取截石位，暴露宫颈，用无菌棉棒擦拭宫颈口分泌物，将专用HPV刷置于宫颈口与粘膜交界处，沿同一方向旋转3～5周，取出刷子，将其置于装有特定保存液的标本瓶内，立即送至检验科进行分析检测。第二代杂交捕获法检测是非放射性检测技术,其阴性预测值高，灵敏度和特异性均较高[12]，而且操作简单，结果客观，不受人为和环境因素影响，重复性好。有研究显示，HC2单独检测的敏感度及特异度优于TCT单独检测，但由于该方法对检测仪器要求较高，检查费用昂贵，结果受取样量和宫颈病变程度等因素的影响，假阳性率较高，不能对HPV进行精确分型，并且也无法准确判断宫颈病变的程度，常与细胞学筛查方法联合应用。

3.2 酶切信号放大法(Cervista)

酶切信号放大法是由美国HOLOGIC公司开发，被美国FDA批准应用于临床检测HPV DNA的专利技术。先使用高危型人乳头状瘤病毒酶切信号放大法(Cervista HPV HR)不分型检测试剂盒检测HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68等14种高危型HPV，Cervista HPV HR检测结果为阳性的标本，再用Cervista HPV16/18分型检测试剂盒行HPV16和HPV18分型检测。检测过程:①Cervista DNA的提取;②Cervista检测信息的录入;③Cervista高危型HPV检测;④荧光阅读仪的读数;⑤结果分析判断。该技术对所检查的14种高危型HPV DNA具有较高的敏感性和特异性，对子宫颈癌前病变的阴性预测值也较高[13]。有学者研究认为Cervista同HC2、以及多色荧光杂交技术、实时荧光定量PCR技术、PCR反向点杂交技术检测结果一致性良好,都是检测HPV的有效手段。但病毒是否处于感染阶段及病毒是否致癌，该方法无法进行判断，容易导致过度医疗，同时也增加了对HPV不是很了解的患者的焦虑和担忧，且其特异性较差，容易误诊，尤其对30岁以下的年轻女性危害更大[14]。

3.3 Care HPV

Care HPV是一种简单、快速、廉价的HPV DNA检测技术，在经济欠发达和医疗资源贫乏地区子宫颈癌防治领域中具有广阔的应用前景[15]。2014年中国山西省襄垣县作为试点之一首先引进该项技术。Care HPV技术原理是利用核酸杂交和信号扩大的方法，捕获HPV DNA并产生化学光对14种高危型HPV(HPV16，18,31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)进行检测。其体位和子宫颈暴露情况与上述两种方法相同，使用专门取样器在宫颈口处取材，沿同一方向旋转6周并停留10s，将取出的样本置于保存液中后立即送至检验科，采用Care HPV方法进行检测。Care HPV筛查技术的灵敏度和特异性分别可达到90.0%和84.2%，接近HC2技术，但费用仅为其1/10[16]。该方法操作简便，设备简单，试剂保存不需要特殊条件，对专门技术人员培训简单，出结果迅速。因此该方法适合用于经济不发达国家及医疗条件匮乏的地区。

3.4 Cobas 4800(实时荧光定量PCR法)

Cobas 4800检测技术:①样本制备:自动化提取HPV和宿主细胞DNA。②扩增检测:分别采用与HPV和β球蛋白特异性互补的引物及荧光标记特异性寡聚核酸探针，通过实时荧光定量PCR对靶序列进行扩增检测。Cobas 4800检测结果主要基于四种不同的荧光染料标记的寡核苷酸探针对靶序列进行监测，这四种荧光染料分别用于检测12种高危型HPV(31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)、HPV16、HPV18和β-球蛋白。β-球蛋白是整个检测过程的内标(internal control，IC)，最终检测结果以扩增反应的循环数(Ct值)表示，根据系统自带的分析软件实现定性检测。该方法可同时检测14种高危型HPV。实时荧光定量PCR技术从根本上解决了PCR扩增产物被污染和不能定量的问题[17],具有快速简便、灵敏度高、特异性强的优点。其不会与低危型HPV发生交叉反应，与HC2相比，其检测范围更为广泛，特异性更强，对于HPV16/18的辨别性高，应用前景较为广阔[18]，但研究表明，单独行高危型HPV检测仍然有较高的漏检率，不利于子宫颈癌的精准筛查。

3.5 Aptima HPV E6/E7表达检测法

美国FDA已于2012年批准了全球第一个基于E6、E7 mRNA的高危型HPV检测试剂盒-Aptima HPV[19]。E6和E7基因首先转录大量的E6、E7 mRNA，然后再由mRNA翻译成相应的致癌蛋白，该蛋白通过降解抑癌蛋白p53和视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)失活使被感染的细胞可无限增殖并恶性转变，所以E6、E7 mRNA的大量表达是细胞发生高级别病变的一个信号。此方法采用支链DNA技术测定所有患者HPV E6/E7 mRNA的表达情况。采用一次性宫颈采样刷收集宫颈脱落细胞，放置于细胞保存液中并立即送检。结果判定：拷贝数≥1 copy/mL为检测阳性(+)，反之为阴性(-)。前四种一代HPV DNA检测方法,敏感性较高，但特异性较低，此种检测方法进一步减少了对一过性HPV感染的检出，减少了假阳性率，具有更高的临床特异性,这对于早期发现子宫颈癌前病变有重要价值。

4 阴道镜联合宫颈活组织病理检查

4.1 检查方法

患者检查前禁止性生活,检查前3天内确保无阴道冲洗或上药等,检查时间确定在月经干净3～7天后,行阴道镜检查。①观察。观察外阴、阴道、宫颈，先行子宫颈生理盐水实验，为了避免醋酸作用不充分而影响结果判读，用3%～5%的醋酸浸泡1 min后再进行观察；②定位。涂碘溶液定位；③再观察。病变部位放大10～40倍，观察其血管与上皮病变，区分鳞柱上皮与转化区；④取样。为便于了解病变范围，对可疑者行病理活检。

4.2 诊断标准

异常阴道镜可见子宫颈不典型转化区与可疑浸润癌,不典型转化区包括醋酸白色上皮、白斑、点状血管、异型血管及镶嵌。醋酸不着色为阳性，可见白色上皮，边界模糊，拟诊为子宫颈鳞状上皮内病变(CINI)；白色上皮，边界较清，可见子宫颈鳞柱上皮交界转化区，拟诊为CIN Ⅱ；白色上皮，边界清楚，可见增粗点状血管，涂碘不着色，拟诊为CIN Ⅲ。出现复杂图形，如异形血管、猪油样改变或岩石状突起等为浸润癌[7]。

该方法将病变部位放大，便于发现微小病变，结合子宫颈活组织病理检查，可以精确取材，有较高的诊断率。但该方法不能检查到宫颈管内的病变，而且绝经期女性子宫颈鳞柱上皮交界区萎缩上移，也为诊断带来一定难度，此方法在一定程度上还受检查医师的技术水平影响，造成一定的漏诊率。

5 分子标志物相关检测

生物标志物检测联合细胞形态学筛查可更准确地发现子宫颈高级别病变，从而及时采取干预措施，达到一级预防目的。迄今为止，研究较多的是抑制蛋白p16INK4A(p16)、增殖细胞相关核抗原Ki-67等。p16作为一种抑癌基因，其失活后能够引起宿主细胞无限生长。Ki-67能够加快肿瘤的发生、发展，并反映肿瘤细胞的增殖速度，且其表达水平越高，说明病变程度越高。只有p16/Ki67双染均阳性，才提示宫颈HPV持续感染。2015年美国妇产科医师学会的子宫颈癌筛查过渡期指南中指出HR-HPV筛查的灵敏度高于细胞学，但特异性不满意。p16/Ki67双染是近年来新出现的子宫颈病变检出手段，该方法减少了筛查中对细胞学检测方法的依赖。如果同一细胞中检测到p16和Ki67共表达，可作为细胞周期失调的标志物，强烈提示子宫颈高级别病变[20-21]。

6 小结与展望

子宫颈癌是威胁女性健康的第二大“杀手”，但其是可以通过早预防、早诊断、早干预就能扼制的恶性肿瘤。2017年HPV疫苗在我国大陆正式上市，但疫苗接种并不理想，全民对HPV的认识度不高，为了让人们更好的认识HPV防治知识，由国际乳头瘤病毒学会(IPVS)发起，从2018年起，每年的3月4日都被定为了“国际HPV知晓日(HPV Awareness Day)”，到现在已有三个年头。作为医生除了宣传，最重要的是要做好癌前病变的筛查工作，守住癌前的最后一道防线。子宫颈癌的筛查方法从细胞学检查到HPV检测，再到近几年发展起来的分子标志物检测法，方法层出不穷，但如何选择合适的筛查方法是医生一直探讨的问题。单一某种筛查方法都不能达到高临床特异性、高阳性预测值、高敏感性，这就要求我们选择多种筛查方式联合检测，才能达到不漏诊、精准筛查。最后就是对筛出的高级别子宫颈鳞状上皮内病变尽早给予干预治疗。这样战胜子宫颈癌指日可待。