Alipogene Tiparvovec基因治疗家族脂肪酶缺陷症的现状

全海燕,江 兴

(1.湖南环境生物职业技术学院,湖南 衡阳 421001；2.南华大学附属第二医院，湖南 衡阳 421001)

脂蛋白脂肪酶缺乏症(lipoprotein lipase deficiency，LPLD)是一种罕见的常染色体隐性疾病。其病因主要是脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)基因发生突变，使LPL蛋白功能异常，进而导致血液中的甘油三酯和乳糜微粒显著增加[1]。LPLD患者主要是LPLS447X发生突变。人类LPLS447X突变与正常的LPL基因相比，基因序列、LPL生物活性、LPL合成和分泌都不同。在白种人群中，这种LPLS447X基因突变体自然发生率大概在20%。临床表现为高脂血症和严重高甘油三脂血症，常见的并发症包括糖尿病、高血压和胰腺炎等。胰腺炎是主要的危险因素，明显增加胰腺癌的风险，导致心血管疾病发病率和死亡率显著上升[2-5]。治疗LPLD关键目的是减少甘油三酯(TG)水平，使机体接近正常水平，从而减少胰腺炎的危险性。临床上使用降低TG药物(比如烟酸类药物)不能有效地降低LPLD患者的TG[1-4]。其基因替代治疗法提供了一个新颖的治疗方法，Alipogene Tiparvovec基因治疗是LPLD的有效方法。本文综述Alipogene Tiparvovec药效学和临床研究，以与同行商榷。

1 Alipogene Tiparvovec生物学功能

Alipogene Tiparvovec(Glybera；AMT-011；AAV1-LPLS447X)是通过腺病毒载体(AAV1)把LPLS447X整合入肌细胞，从而使机体产生正常的LPL。LPL降低血浆中TG水平，从而达到治疗目的[5]。临床前研究使用C57BL/6(肝脏中敲除LPL)动物模型，观察Alipogene Tiparvovec在组织中的分布情况，发现小鼠肌肉注射Alipogene Tiparvovec，AAV1-LPLS447X基因组能稳定表达并且保存在肌肉细胞，调控LPL生物活性。在敲除LPL小鼠模型中，用AAV1-LPLS447X治疗，与野生型的LPL相比，血浆中HDL双倍增加，TG水平降低3倍[6]。在LPLD患者的临床中，肌肉注射Alipogene Tiparvovec，肌肉中LPL基因以LPLS447X形式表达。

2 药效学研究

Alipogene Tiparvovec基因的药代动力学和药效动力学研究发现，腿部肌肉注射高浓度Alipogene Tiparvovec，持续治疗12个月，蛋白质分解代谢途径检测Aipogene Tiparvovec含量，生物数据分析发现Aipogene Tiparvovec都集中在肌肉组织。大部分DNA病毒是在血液中，DNA病毒的清除按照每周1～2(mg/dL)的速度。基于病毒传染分析，Alipogene Tiparvovec治疗后，在尿液中10周发现DNA，12周发现在唾液中，而精液长达26周。但到目前为止，在病人的血清中没有发现DNA病毒[7]。

LPLD诊断必须通过基因检测来证实，不能仅限于检测患者LPL的蛋白质含量。对Alipogene Tiparvovec基因治疗的LPLD患者，如患者有严重的家族性LPLD遗传背景或者还患有胰腺炎时，要进行膳食脂肪的控制。Alipogene Tiparvovec基因治疗应该由训练有素的专家进行肌肉注射，不能进行静脉注射。Alipogene Tiparvovec基因治疗后的6到12个月，应监控测量腺病毒相关载体水平、T细胞反应、LPLS447X水平。临床上，实施基因治疗的3天之前和12周后，需要结合免疫抑制剂，如环孢素免疫抑制剂方案(每天3mg/kg)和霉酚酸酯(每天291g)。此外，基因治疗前，还需要静脉注射甲基强的松龙1 mg/kg。

有研究报道，用AAV1-LPLS447X基因治疗的27个参与者中，有18个个体表现出对AVV1的免疫性。AAV1载体是潜在的哺乳动物宿主基因组，虽然低频率，但是有增加肿瘤的风险。临床通过肌肉注射Alipogene Tiparvovec治疗5个LPLD治疗患者的肌肉组织样本的DNA分析，发现AAV1-LPLS447X优先集中在线粒体上。提示AAV1载体在肌肉等组织分裂相对缓慢。有研究报道，重组的AAV1病毒在200个患者，并没有发展成肿瘤[8]，说明Alipogene Tiparvovec安全性能较高。Alipogene Tiparvovec治疗后，大概有一半的病人T细胞对AAV1有反应，说明AAV1载体介导的基因转移与T细胞介导的免疫反应相关联。但是，不能检测到T细胞对LPL的反应。也就是说，T细胞对AAV1的反应没有明显影响到Alipogene Tiparvovec治疗的安全性、有效性[7-8]。

患者对Alipogene Tiparvovec基因治疗的一般耐受性良好。常见的不良反应是直接注射部位的局部反应，包括水肿、腿痛和肌痛，疼痛的级别是轻度至中度，但在几天内会得到缓减[9]。发生头痛、肢体疼痛、疲劳、高热和挫伤的概率大于10%；发生包括食欲下降、低血糖、烧灼感、头昏、脂血症、高血压、肺栓塞、腹痛、黄色瘤、寒战小于10%；治疗7周后，有一个病人出现了肺栓塞，认为与基因治疗关联不大[9]。

3 临床研究

评估Alipogene Tiparvovec的临床疗效之前，记录受试者的TG水平，培养同样的生活习惯，筛选出胰腺炎病史并且肌肉注射AAV1-LPLS447X。为了观察唾液、尿液、精液中DNA的脱落情况和免疫反应，研究者在临床研究过程中，将受试者分为成4组，即Ⅰ期临床研究(CT-AMT-010-01)、Ⅱ期实验研究(CT-AMT-011-01)、Ⅲ期实验研究(CT-AMT-011-02)和胰腺炎风险的临床研究(CT-AMT-011-03)[10-12]。疗效评估阶段是在注射基因后12到14周，安全跟踪持续长达15年。

3.1 Ⅰ期临床研究

Alipogene Tiparvovec治疗主要的目标是有效减少患者空腹血浆中40%TG。在Ⅰ期临床研究(CT-AMT-010-01)的最初12周，LPLD病人分别给予肌肉注射注射低剂量和高剂量的AAV1-LPLS447X，TG水降低到基线，高剂量组和低剂量组分别降低了27%到41%。之后18～31个月的实验跟踪中，血浆TG水平并没有低于基线水平。在12周Alipogene Tiparvovec基因治疗中，14个由于LPLD引起严重的高甘油三脂血症和遗传性胰腺炎患者，其中2个患者注射3×1011gc/kg剂量的Alipogene Tiparvovec并没有注射免疫抑制剂；4个患者以3×1011gc/kg结合口服环孢素共同治疗；剩下8个病人以剂量1×1012gc/kg剂量的Alipogene Tiparvovec并且结合相同的免疫抑制方案。1×1012gc/kg剂量组患者耐受性良好，3×1011gc/kg也没有严重的不良反应事件。1×1012gc/kg剂量组4名受试者中1名患者和3×1011gc/kg组中的2名患者TG水平降至10 mmol/L。该项研究在3～12周，一半的受试者空腹TG水平降低到40%；1×1012gc/kg治疗剂量组的TG基线水平明显降低。4个患者TG水平降低到<10 mmol/L。在Alipogene Tiparvovec治疗16到26周后，虽然TG水平和预处理水平增加，但是乳糜微粒的TG和胆固醇含量减少。在可评价的肌肉活检实验中，Alipogene Tiparvovec持续治疗26周后，LPLS447X表达增加，有三个样本测试LPL蛋白质呈现阳性，5个显示细胞内脂质增加。基于以上研究的结果，确定Alipogene Tiparvovec治疗剂量1×1012gc/kg为最佳剂量[10]。

3.2 Ⅱ期和Ⅲ期临床研究

在第Ⅰ期临床结果的基础上，在第14周进行Ⅱ期和Ⅲ期研究。Ⅱ期和Ⅲ期研究是评价Alipogene Tiparvovec基因法治疗法过程中免疫反应、空腹甘油三酯水平、LPLS447X在肌肉组织中的表达情况以及胰腺炎的发生与LPLD并发症。把Ⅱ期实验研究命名为CT-AMT-011-01。同样把实验组随机分为3个剂量组，分别为3×1011gc/kg组、3×1011gc/kg和免疫制剂合用组、1×1012gc/kg和免疫制剂共肌注组[13]。实验结果表明餐后Alipogene Tiparvovec并不引起免疫反应。接下来进行Ⅲ期研究临床研究，并把实验命名为CT-AMT-011-02。以1×1012gc/kg和免疫制剂肌肉注射，观察甘油三酯水平和脂蛋白代谢，脂蛋白动力学与游离脂肪酸(FFA)的转化、富含甘油三酯的脂蛋白含量与密度、肌肉组织的表达LPLS447X基因等。在Alipogene Tiparvovec基因治疗后2周和14-52周，分别检测乳糜微粒代谢、血浆中游离脂肪酸和甘油摄入等情况[9]。实验结果表明，患者基线TG水平>11 mmol/L，治疗14周，显著改善餐后乳糜微粒代谢，甘油水平没有明显的变化，餐后血浆TG总水平下降大约60%，提示乳糜微粒TG有明显地减少(大约80%)，胆固醇TG与血浆TG比率降低。胆固醇TG与血浆TG比率接近，大多数认为乳糜微粒导致疾病，并且存在诱发胰腺炎的因果关系。在14周，明显减少6小时餐后乳糜微粒峰值和24小时乳糜微粒活动曲线。LPLD患者，乳糜微粒52周持续高峰值。以上的实验结果表明，Alipogene Tiparvovec基因治疗法有较低的免疫反应、TG水平降低、乳糜微粒TG减少、乳糜微粒清除和较长的LPLS447X基因生物效应的特征。

3.3 对胰腺炎风险的临床研究

在CT-AMT-011-01、CT-AMT-011-02实验结果的基础上，评估LPLD患者急性腹痛的发生率和胰腺炎发生率。胰腺炎风险的临床研究组称为CT-AMT-011-03[14]。Alipogene Tiparvovec基因治疗后，进行3年追踪发现，在3到10年之间，Alipogene Tiparvovec基因治疗作用可控制，实验结果表明，Alipogene Tiparvovec基因治疗在一定程度上能减少胰腺炎发生的风险，胰腺炎风险比率从0.38降低至0.31[13]。结果提示，Alipogene Tiparvovec基因治疗显著降低胰腺炎风险，可能提高了患者的生存率。

4 Alipogene Tiparvovec治疗家族脂蛋白脂酶缺乏症的现状

人们以往对脂蛋白脂肪酶缺乏症的治疗无有效方法[15]。Alipogene Tiparvovec基因疗法，使患者体内LPL功能恢复、纠正细胞LPL基因变异，使LPLD患者肌细胞TG水平和乳糜微粒水平降恢复到正常水平。临床研究发现，Alipogene Tiparvovec基因治疗与LPLD患者血脂水平密切相关。Alipogene Tiparvovec基因治疗12到14周后，血浆TG水平显著降低40%～60%，治疗16～26周，尽管TG水平达到预处理水平，但是血脂水平并没有明显的变化。在52周的追踪中，持续改进患者餐后乳糜微粒的新陈代谢，增减LPLS477X的表达。此外，后6年的随访，临床相关记录发现，胰腺炎发生率和腹痛事件降低。虽然这些结果是基于回顾性分析，所有这些都有固有的局限性，但是为LPLD患者治疗提供了新的研究方向。

值得注意的是，AAV1作为基因转移的载体，一方面AAV1载体有潜在的致癌性，另一方面AAV1载体诱导体液免疫和细胞免疫，从而影响基因药物的疗效和安全性。虽然AAV1病毒载体通过调控细胞免疫和体液免疫，但这些免疫反应没有改变LPL基因持续表达，也不影响LPL生物活性。

5 总结与展望

Alipogene Tiparvovec基因药物是目前有效治疗LPLD疾病有效药物，主要是通过肌内给药方式，既保留了治疗药物的所需浓度，又避免了药物的耐药性和毒性。但是，Alipogene Tiparvovec基因药物在欧洲上市是比较困难，一部分原因是LPLD的患者非常少见，参与临床研究仅有27例。因此，Alipogene Tiparvovec基因药物的疗效还需要进一步探索。