上海市警犬寄生蜱种鉴定及其携带的原虫及微生物组分析

张维谊，姚佳玲，周珂珂，周勇志，陆金苗，陈兆国，龚海燕

（1.上海市农产品质量安全中心 200335；2. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

在我们的生活环境中，除了夏天随处可见的蚊子之外，还有一种隐秘存在的外部吸血寄生虫-蜱。我国的蜱有2科、10属，117种[1]，分布于全国各地，从北端的哈尔滨到南方的海南岛，从西部西藏到东部上海，且随着地域的变化，生存的优势蜱种也存在差异[2-3]。蜱不仅大量吸血，还会传播多种病原，包括83种病毒（森林脑炎病毒、布尼亚病毒等）、14种细菌（布鲁氏杆菌等）、20种立克次体、18种螺旋体（引起莱姆病）、32种原虫（巴贝斯虫等）、1种衣原体、1 种支原体、1种巴尔通氏体和2种线虫[4]。2010年，河南省信阳市境内发生多起蜱叮咬人致死事件，疑似为感染无形体或者布尼亚病毒而死[5]。此外，2018年以来，我国猪场大面积爆发非洲猪瘟（african swine fever，ASF），软蜱则具有保存病毒的作用[6]。最近，报道的蜱传新病原阿龙山病毒更是引起了人们的广泛关注[7]。刘琴等[8]在上海嘉定、闵行、浦东、松江、黄浦、金山6个区的犬体表捕获了300多只蜱，经鉴定优势蜱种为血红扇头蜱。刘洪霞等[9]采集上海2015～2016年犬、羊体表蜱，发现血红扇头蜱和长角血蜱为上海优势蜱种。但是，两则报道均未对蜱携带病原进行分析。为了进一步明确上海警犬体表的蜱所携带的潜在病原或者微生物，我们对警犬体表收集的蜱进行了蜱种鉴定和高通量测序，以此明确蜱携带的微生物对动物或者人类可能带来的威胁，并为蜱传病的防控提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 蜱的收集与预处理检查警犬耳朵、腹股沟、前后腿内侧、背部、颈部等部位，发现蜱后，用镊子紧夹蜱的假头基，顺着蜱尾部对应的方向拽下。为了减少蜱体表微生物的污染，在实验室用75%酒精漂洗3次，然后用ddH2O漂洗3次后，保存于-80℃，待用。

1.2 蜱的形态学观察在体视显微镜（Nikon SMZ25）下，观察每只雄蜱和雌蜱的形态，重点是假头、肛侧板、副肛侧板和盾板等，由此确定蜱的种属。

1.3 蜱种的分子生物学鉴定将收集并清洗的雌蜱和雄蜱各10只以上分别放在两只消毒灭菌的研钵中，放入液氮，研磨充分以形成雌蜱和雄蜱两个样本池，然后用PBS反复清洗，收集洗下来的混合物，10 000×g离心10 min，收集上清保存于-80℃用于后续病毒组研究。沉淀物采用DNA快速抽提试剂盒（FastDNATMSPIN extraction kits，MP，上海）抽提DNA，并通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量。然后根据文献[10]提供的针对细胞色素c氧化酶亚单位I（COXI）基因设计的引物（表1），在50 μL反应体系（10×ExTaq反应缓冲液5 μL、dNTP 4 μL、ExTaq酶 0.4 μL、10 μmol/L上游引物 2 μL、10 μmol/L下游引物2 μL、DNA模板 1 μL、ddH2O 35.6 μL）中进行PCR扩增，反应条件：94℃预变性5 min，35个循环（94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min），72℃延长7 min。用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）纯化DNA片段，送到Invitrogen公司进行测序，测序后的序列在国际NCBI数据库中进行核酸序列的比对（Blast），并用MEGA6.0构建进化树，以明确此蜱种与其他地区获取的蜱的亲缘关系。

1.4 蜱携带原虫的检测为了检测蜱所携带的原虫，以蜱DNA为模板，扩增巴贝斯虫的引物为Bab1-F/Bab1-R和Bab2-F/Bab2-R，扩增泰勒虫引物为BT1-F/BTH1-R和BT1-F/BT1-R，均采用套式PCR，引物序列见表1。反应体系：rTaq酶25 μL，上游引物3 μL，下游引物3 μL，ddH2O 17 μL，DNA模板2 μL。巴贝斯虫PCR反应条件：94℃预变性3 min，35个循环（94℃变性45 s，56℃退火35 s，72℃延伸1 min），72℃延长15 min。泰勒虫第一轮PCR反应条件：94℃预变性10 min，30个循环（95℃变性45 s，65℃退火加延伸90 s），72℃延长10 min；第二轮PCR反应条件：94℃预变性10 min，30个循环（95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s），72℃延长10 min。

表1 套式PCR引物序列Table 1 Primers used in nested PCR

1.5 蜱携带微生物的检测根据文献[11]中提供的引物，对应细菌的16S V3-4区（338F：5'-ACTCCTAC GGGAGGCAGCA-3'，806R：5'-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3'）进行扩增。扩增体系（25 μL）：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L） 2 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNA Polymerase 0.25 μL。扩增参数：98℃预变性 2 min，30个循环（98℃变性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），最后72℃延伸5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，其中的500 bp左右的条带经凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）纯化回收，并用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit构建测序文库（Illumina公司）。文库经质检和定量后，在MiSeq测序仪上进行高通量测序。测序和分析在上海派生诺生物科技股份有限公司完成。

1.6 数据分析测序数据经初步筛查，并用QIIME软件识别和剔除疑问序列和嵌合体序列。此后，将序列进行OTU（可操作分类单元）归并划分，每个OTU的代表序列用于分类地位鉴定以及系统发育学分析。根据OTU在不同样本中的丰度分布，评估每个样本的多样性水平。

2 结果

2.1 蜱的种属鉴定警犬体表获得的雄蜱，显微镜下可明显地观察到雄蜱假头基呈六边形，有明显的肛侧板。雌蜱在显微镜下同样可观察到其假头基呈六边形。两者均有扇头蜱的典型特征[12]，因此定义为扇头蜱属（图1）。通过PCR扩增，在雌、雄蜱DNA中均可扩增得到720 bp的条带（图2），与预测结果一致，进一步测序发现这与血红扇头蜱（Rhipicephalus sanguineus）的COXI序列一致。经MEGA6分析，其序列与此前上海报道的血红扇头蜱序列100%同源，与其他来源的广西株亲缘关系最近（图3）。

图1 雄蜱和雌蜱的形态学观察Fig.1 Morphology of male and female ticks

图2 PCR扩增COXI结果Fig.2 PCR amplification of COXI gene

图3 上海警犬寄生蜱的COXI序列的进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree constructed according to the COXI sequences from the ticks fed on police dogs

2.2 蜱携带原虫的鉴定经巴贝斯虫套式PCR引物扩增，上海警犬寄生雌蜱DNA中得到1672 bp的产物，测序结果为犬巴贝斯虫（Babesia canis，图4A），而雄蜱泳道上的扩增条带经测序证明非巴贝斯虫DNA序列，表明未携带巴贝斯虫。经泰勒虫套式PCR扩增，得到410 bp的条带，测序仍然表明为巴贝斯虫序列，而雄蜱扩增片段则为未知的真核生物DNA序列，因此表明未携带泰勒虫。

图4 蜱体内巴贝斯虫(A)和泰勒虫(B)的检测Fig.4 Investigation of Babesia(A) and Theileria(B) in ticks

2.3 蜱携带微生物的分析与比较经剔除疑问序列后，雌雄蜱分别检出42 936和43 006个reads。根据OTU划分和分类地位鉴定结果，可以获得蜱样本在各分类水平的具体组成。上海警犬体表蜱携带微生物总体情况，见表2。图5显示了雌雄蜱体内微生物组成比例。蜱常见携带病原中，雌、雄蜱携带柯克斯体属（Coxiella）分别占比2.9%、0.4%，而布鲁氏杆菌属（Brucella）在雌蜱和雄蜱携带微生物中分别占比1.0%、3.1%。其他常见病原微生物，立克次体（Rickettsia）、螺旋体属（Spiroplasma）等在上海蜱中未检出。

表2 上海警犬寄生蜱携带微生物种类Table 2 Species of microorganisms carried by ticks from Shanghai police dogs

3 讨论

在本研究中，我们第一次对上海警犬体表寄生蜱携带的原虫及微生物进行了检测。经鉴定，上海某警犬基地的犬携带蜱为血红扇头蜱，这与之前报道的上海的优势蜱种一致[5]，也与2004年[13]及2008年[14]警犬体表蜱的调查结果相同。

经PCR扩增测序，发现犬体表的雌蜱携带犬巴贝斯虫，但是雄蜱则未检测到，此暗示了犬血液中有巴贝斯虫感染，但需要对犬血液进行血清学调查进一步确认。此外，雌蜱带巴贝斯虫而雄蜱不带的原因，可能是与吸血过程中雌蜱吸血量较雄蜱多有关。王望宝等[15]于2007年～2011年间采集了多个警犬技术工作单位的犬体表蜱，进行蜱种鉴定和流行病学调查，发现警犬感染蜱的情况在18个省、4个自治区、2个直辖市普遍存在，其中8个单位蜱体内检测到韦氏巴贝斯虫（Babesia vogeli）。王华素等[16]于广西南宁某警犬养殖训练基地采集的警犬体表蜱均为血红扇头蜱，并在蜱体内扩增到田鼠巴贝虫（Babesia microti），阳性率为27.8%（5/18）。由此表明，巴贝斯虫在警犬体表蜱中具有较高的感染率，需要对警犬体表的蜱进行巴贝斯虫感染监测。

上海蜱携带的病原微生物种类相对较少。其中，柯克斯体是引起人兽共患自然疫源性疾病-Q热的主要病原，可由携带病原的扇头蜱属、血蜱属等叮咬传播从而引发疾病，病程急，有高热，头痛，肌肉酸痛[1]等症状。在上海采集的雌蜱体内，柯克斯体占总微生物含量的2.9%，且比雄蜱含量高，可见此病原经雌蜱传播的可能性更大。除了柯克斯体之外，在雌雄蜱中，均检出布鲁氏杆菌属（Brucella）。早期，在南汇牧羊犬中发现了布鲁氏杆菌[17]，实验用比格犬中阳性率23.4%[18]，家养犬阳性率为10.5%[19]。此研究则通过蜱的携带状况间接反应了警犬感染布鲁氏杆菌病的状况。其他常见蜱传病，如引起人莱姆病的伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）、引发人粒细胞无形体病的无形体（Anaplasma）以及引起人埃立克体病的埃立克体（Ehrlichia）[1]均未被检测到，但是柯克斯体和布鲁氏杆菌的出现应该引起相关部门足够警惕。

图5 蜱携带微生物所占比例与比较分析图Fig. 5 Comparation and the composition of microbial community in ticks