淫羊藿苷调控Wnt/β-catenin信号通路干预大鼠MSCs成脂成骨双向分化实验研究①

李智奎 孔俊博 赵王林

(云南省中医医院骨伤科，昆明 650021)

骨质疏松症是由骨代谢障碍引发的一种全身性疾病，临床表现为骨密度减少、骨脆性增加、骨微结构发生变化，容易发生骨折等，常见于老年人[1]。随着我国社会逐步的老龄化、骨质疏松症也日渐成为影响人们生活健康的主要因素，因此针对骨质疏松的治疗就显得尤为迫切和重要[2]。目前针对骨质疏松的致病原因特别是发病机制还不是很清楚，临床上对骨质疏松的治疗效果不是很理想，越来越多的证据表明骨髓间充质干细胞的功能异常是导致骨质疏松的原因之一[3]。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种来源于中胚层具有多向分化功能的细胞，在特定的刺激条件下可以向骨或者脂肪转化，是治疗骨质疏松症的理想方案[4]。MSCs在成骨或者成脂分化方向主要由不同的转录因子调控，目前研究认为其成脂分化由特异性基因PPARγ、Adipsin和FABP4调控，而成骨分化主要由RUNX2、ALP和OPN调控[5]。研究认为促进骨MSCs成脂分化的调控因子同时会抑制其成骨分化，反之亦然[6]。MSCs向成脂方向分化增加则成骨分化减少，此时骨髓内的脂肪含量会增加，从而导致成骨分化的减少，长期则会造成骨质疏松症。

传统中医药博大精深，对骨质疏松具有很好的治疗效果。淫羊藿苷是一味传统的温肾阳、强筋骨的中药，在临床上经常用来治疗骨质疏松。有文献报道淫羊藿苷可以有效促进MSCs向成骨方向分化而抑制其成脂分化[7]，但是其具体的调控机制尚不清楚。

因此本研究以大鼠的MSCs为研究对象，探讨了不同浓度淫羊藿苷对其成骨成脂分化的作用以及具体的机制，为淫羊藿苷在临床上治疗骨质疏松提供可靠的实验依据和药物作用靶点。

1 材料与方法

1.1材料 1周龄SD大鼠乳鼠(中科院昆明动物研究所，中国)；淫羊藿苷(云南省食品药品检验所，中国)；高糖DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液(HyClone，美国)；蛋白酶抑制剂(Roche，美国)；青链霉素混合液(Solarbio，北京)；β-actin、RUNX2、ALP、OPN、PPARγ、Adipsin和FABP4抗体(Abcam，英国)；ECL化学发光试剂盒购自美国Advansta，兔二抗购自英国 Abcam；CCK-8试剂盒(湖北天根生物，中国)；RNA逆转录试剂盒(TaKaRa，日本)；Wnt/β-catenin信号通路小分子抑制剂PNU-74654(selleck，美国)；碱性磷酸酶活性检测试剂盒(Wako,日本)；骨钙素检测试剂盒(信然生物，中国)。

1.2方法

1.2.1大鼠MSCs的分离培养和纯化 SD大鼠乳鼠脱臼处死，无菌手术操作台取出大鼠双侧的股骨和胫骨。随后消毒的手术剪在股骨和胫骨干骺端处剪断，5 ml无菌注射器抽取骨髓间充质干细胞培养液，然后反复冲洗骨髓腔。将冲洗液混匀后，制备成细胞悬液接种至5 cm2培养瓶中，5%CO2和37℃细胞培养箱。48 h后换液，之后每2 d换一次液。当细胞密度长至70%左右，0.25%胰蛋白酶消化细胞，按照1∶2比例接种至75 cm2培养瓶中，以此方法获得第3代骨髓间充质干细胞备用。

1.2.2免疫荧光检测CD44和CD90 各组对数生长期细胞，铺板爬片，4%多聚甲醛固定，细胞破膜液浸泡破膜，PBS清洗，加入荧光标记的CD44和CD90一抗后4℃过夜，次日室温30 min后吸取一抗PBS清洗，随后显色脱水，封片，荧光显微镜下观察CD44和CD90表达情况。

1.2.3qRT-PCR TRIzol和氯仿用来提取获得RNA，使用RNA逆转录试剂盒将RNA逆转录成性质稳定的cDNA。随后qRT-PCR仪器检测目的基因相对β-actin的表达水平。反应条件设定如下：在95℃预变性10 min；在95℃下退化10 s;在60℃下退火20 s并在72℃下延伸35 s。该2-ΔΔCt方法用于计算目的基因相对mRNA表达。引物序列如下。RUNX2：Forward 5′-GCACCCAGCCCATAATAGA-3′，Reverse 5′-TTGGAGCAAGGAGAACCC-3′；ALP：For-ward 5′-CAAGGACCAACTACAACCA-3′，Reverse 5′-AG-GGAAGGGTCAGTCAGGTT-3′；OPN：Forward 5′-CCTGGACCTCATCAGCATTT-3′，Reverse 5′-GGAGACAGGAGGCAAGG-3′；PPARγ：Forward 5′-CCTTTACCACGGTTGATTTCTC-3′，Reverse 5′-GGCTCTACTTTGATGCACTTT-3′；Adipsin：Forward 5′-CACGTGTGCGGTGGCACCCTG-3′，Reverse 5′-CCCCTGCAAGTGTCCCTGCGGT-3′；FABP4：Forward 5′-GCGTAGAAGGGGACTTGGTC-3′，Reverse 5′-TTCCTGTCATCTGGGGT-GATT-3′；β-actin：Forward 5′-ACCCACTCCTCCACCT-TTG-3′，Reverse 5′-CACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.2.4CCK-8增殖实验 收集对数期细胞，调整细胞数4×105个/孔铺板，随后分别加入不同浓度的淫羊藿苷(10、20、30、40和50 ng/ml)，以正常培养MSCs为空白对照组，37℃、5% CO2培养箱内培养1～4 d。结束后每孔加入20 μl CCK-8试剂，避光3 h，摇床振荡15 min。设置酶标仪450 nm检测细胞CCK-8混合液OD值进行活力分析。

1.2.5PNU-74654对淫羊藿苷作用于MSCs成骨和成脂分化的影响 Wnt/β-catenin信号通路的小分子抑制剂PNU-74654(10 μmol/L)作用于MSCs 30 min以阻断Wnt/β-catenin信号通路，接着用淫羊藿苷(10 ng/ml)刺激MSCs，并与MSCs共孵育3 d，检测成骨和成脂基因的表达。

1.2.6Western blot 调整MSCs细胞数5×104ml-1，80%细胞密度时收集细胞，PBS洗涤1 min后加含有蛋白酶抑制剂的裂解液放置冰上裂解，30 min 后高速离心吸抽蛋白。蛋白定量完成后加上样缓冲液，沸水煮5 min。SDS-PACE电泳后进行转膜操作，转膜成功后用脱脂牛奶进行封闭，PBST清洗，均为1∶1 000稀释一抗，室温孵育1 h后4℃过夜。次日反复清洗条带，加二抗室温孵育90 min，PBS反复冲洗，发光拍照。

1.2.7骨钙素活性检测 收集对数期MSCs，调整细胞数4×105个/孔铺板，随后分别加入不同浓度的淫羊藿苷(10 ng/ml和40 ng/ml)，37℃、5% CO2培养箱内培养1～3 d。分别于培养第1、2、3天三个时间点收集培养上清液，并密封置于-20℃冰箱保存。于第3天时将所有收集的上清液置于37℃温箱解冻后,按信然生物有限公司OC测定试剂盒的说明书进行操作，设置酶标仪450 nm检测细胞上清OD值进行活力分析。

2 结果

2.1骨髓间充质干细胞的鉴定 全骨髓培养法培养初期细胞以悬浮为主，培养时间延长逐渐贴壁生长，并表现出各种形态，显微镜观察多数呈梭形的成纤维细胞样。而CD44和CD90作为MSCs的阳性标志，为了鉴定分离的细胞是否为MSCs，免疫荧光观察CD44和CD90的表达，结果发现分离培养细胞的阳性标志CD44和CD90均表现出红色荧光遍布胞质(图1)，说明分离的细胞为大鼠骨髓间充质干细胞。

2.2淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响 为了检测淫羊藿苷对MSCs分化的影响，首先检测了其对MSCs增殖作用的影响，10、20、30、40和50 ng/ml 不同浓度的淫羊藿苷分别作用于MSCs 1～4 d，以正常培养MSCs为空白对照组，随后每天CCK-8试剂盒检测MSCs增殖情况，结果发现10、20、30和40 ng/ml淫羊藿苷在1～4 d对MSCs增殖均无影响，但50 ng/ml淫羊藿苷在第3～4天时明显抑制MSCs增殖(P<0.05)，见图2。这说明低浓度的淫羊藿苷对MSCs增殖无影响，而高浓度的淫羊藿苷起到抑制MSCs增殖的作用，因此后续研究不同浓度的淫羊藿苷分别以10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷作为给药浓度。

2.3淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞成脂分化的影响 MSCs向成脂方向分化则成脂的特异性基因PPARγ、Adipsin和FABP4表达会增加。为了检测不同浓度淫羊藿苷对MSCs成脂分化的影响，10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷刺激MSCs 3 d，以正常培养MSCs为空白对照组，随后qRT-PCR和Western blot检测PPARγ、Adipsin和FABP4表达，结果发现与空白对照组相比，10 ng/ml的淫羊藿苷抑制PPARγ、Adipsin和FABP4的表达(P<0.05)；而40 ng/ml的淫羊藿苷与空白对照组相比，则PPARγ、Adipsin和FABP4的表达明显增加(P<0.05),见图3。说明10 ng/ml 的淫羊藿苷可以抑制MSCs的成脂分化，而40 ng/ml淫羊藿苷可以促进MSCs的成脂分化。

图1 免疫荧光检测骨髓间充质干细胞阳性标志CD44和CD90的表达Fig.1 Immunofluorescence detection of bone marrow mesenchymal stem cell positive markers CD44 and CD90 expression

图2 不同浓度淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响Fig.2 Effects of different concentrations of icariin on proliferation of bone marrow mesenchymal stem cellNote:*.P<0.05,***.P<0.001.

2.4淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响 MSCs的成骨分化与成脂分化是双向的，那么10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷成脂分化的不同作用，是否也体现在对MSCs的成骨分化作用上。同样以10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷刺激MSCs 3 d，以正常培养MSCs为空白对照组，随后qRT-PCR和Western blot检测成骨特异性基因RUNX2、ALP和OPN表达，结果发现与空白对照组相比，10 ng/ml的淫羊藿苷显著增加RUNX2、ALP和OPN的表达(P<0.05)；而40 ng/ml的淫羊藿苷与空白对照组相比，则RUNX2、ALP和OPN的表达显著降低(P<0.05),见图4。说明10 ng/ml的淫羊藿苷可以促进MSCs的成骨分化，而40 ng/ml淫羊藿苷可以抑制MSCs的成骨分化。与淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞成脂分化结果相符合。

2.5淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞骨钙素活性的影响 为了进一步验证10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷对MSCs成骨分化的影响，骨钙素检测试剂盒用来检测MSCs骨钙素活性的变化，结果发现与空白对照组相比，10 ng/ml淫羊藿苷可以显著提高骨钙素的活性(P<0.05)；而40 ng/ml的淫羊藿苷则降低骨钙素的活性(P<0.05)，见图5。说明10 ng/ml淫羊藿苷可以促进MSCs成骨诱导后细胞体外钙化，提高细胞内骨钙素活性，促进钙结节形成。

图3 10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞成脂分化的影响Fig.3 Effects of 10 ng/ml and 40 ng/ml icariin on adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cellsNote:A.qRT-PCR results;B.Western blot result.**.P<0.001,***.P<0.05

2.6淫羊藿苷激活骨髓间充质干细胞成骨分化中Wnt/β-catenin信号通路 为了探究淫羊藿苷诱导MSCs成骨成脂分化中Wnt/β-catenin信号通路发挥的作用。用10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷分别刺激骨髓间充质干细胞0、30和60 min后，提取蛋白，Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、Wnt7和GSK-3β。结果表明，与空白对照组相比，10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷均可以显著提高Wnt/β-catenin信号通路活化标志蛋白β-catenin和Wnt7的表达(P<0.05)，抑制β-catenin降解蛋白GSK-3β的表达(P<0.05)，见图6。且这种蛋白调控表达均在淫羊藿苷给药30 min时达到最高值。说明不同浓度的淫羊藿均是激活Wnt/β-catenin信号通路干预MSCs成骨分化或者成脂分化的。

图4 10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞成脂分化的影响Fig.4 Effects of 10 ng/ml and 40 ng/ml icariin on adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cellsNote:A.qRT-PCR results;B.Western blot result.**.P<0.001.

图5 10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞骨钙素活性的影响Fig.5 Effect of 10 ng/ml and 40 ng/ml icariin on osteocalcin activity of bone marrow mesenchymal stem cellsNote:*.P<0.05.

图6 10 ng/ml和40 mg/ml淫羊藿苷对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、Wnt7和GSK-3β的影响Fig.6 Effects of 10 ng/ml and 40 mg/ml icariin on Wnt/β-catenin signaling pathway-related proteins β-catenin,Wnt7 and GSK-3βNote:**.P<0.01,***.P<0.001.

图7 10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞的促成骨基因表达和抑成脂基因表达的效应被PNU-74654 部分阻断Fig.7 Effect of 10 ng/ml and 40 mg/ml icariin on bone-promoting gene expression and inhibition of adi-pogenic gene expression in bone marrow mesen-chymal stem cells was partially blocked by PNU-74654Note:***.P<0.001.

2.7淫羊藿苷调控Wnt/β-catenin信号通路干预骨髓间充质干细胞成骨成脂分化 为了进一步验证不同浓度的淫羊藿苷是通过调控Wnt/β-catenin信号通路干预MSCs成骨分化或者成脂分化。用Wnt/β-catenin信号通路特异性小分子抑制剂PNU-74654(10 μmol/L)给药处理MSCs。在淫羊藿苷刺激诱导MSCs之前，PNU-74654预先给药处理0.5 h，紧接着10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷刺激MSCs 3 d，随后使用qRT-PCR和Western blot检测成骨基因RUNX2、ALP和OPN和成脂基因PPARγ、Adipsin和FABP4的表达情况。结果发现不同浓度淫羊藿苷对MSCs的成骨和成脂分化干预效应均被PNU-74654部分阻断，见图7。说明淫羊藿苷是通过Wnt/β-catenin信号通路干预MSCs成骨分化或者成脂分化的。

3 讨论

骨髓间充质干细胞具有多分化的潜力，可以在一定条件诱导下定向分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成纤维细胞及肝细胞等[8]，针对人体老龄化主要疾病——骨质疏松症具有潜在的治疗价值，MSCs经过特异性条件刺激可以诱导其向成骨或者成脂方向分化。传统中医药作为丰富的医药宝库，对骨质疏松具有很好的治疗效果，而淫羊藿苷作为代表性药物常用于临床治疗骨质疏松。淫羊藿又名仙灵脾，是传统的温肾阳、强筋骨的中药，已有研究表明淫羊藿总黄酮或黄酮各单体都具有抗骨质疏松的作用[9]，但是淫羊藿苷抗骨质疏松的作用如何，其发挥作用的分子机制都尚不清楚。因此本研究以SD大鼠分离纯化的MSCs为研究对象，不同浓度淫羊藿苷刺激诱导MSCs，观察其对MSCs成骨和成脂双向分化的作用。

本研究首先研究了淫羊藿苷对MSCs增殖的影响，初步确定淫羊藿苷的作用浓度，结果发现10～40 ng/ml的淫羊藿苷对MSCs增殖均无影响，而50 ng/ml 的淫羊藿苷从第3天开始显著抑制MSCs增殖作用。为了研究不同浓度淫羊藿苷对MSCs成骨和成脂双向分化干预的研究，在细胞增殖结果的基础上筛选10 ng/ml和40 ng/ml作为后续研究中的两个不同给药浓度。有文献报道PPARγ、Adipsin和FABP4是成脂特异性基因，其在脂肪形成的过程中具有重要的作用，通常作为成脂的标志蛋白用来检测脂肪的形成和增殖[10]，而RUNX2、ALP和OPN是成骨的重要标志蛋白[11]。本研究结果表明，不同浓度的淫羊藿苷，特别是10 ng/ml的淫羊藿苷抑制了MSCs成脂分化促进了成骨，显著降低了PPARγ、Adipsin和FABP4的表达，相反促进了RUNX2，ALP和OPN基因的表达，同时通过油红O染色10 ng/ml的淫羊藿苷显著抑制了脂滴的形成，茜素红染色则表明其促进了钙结节的形成；而40 ng/ml的淫羊藿苷则表现出了相反的实验结果，其促进了MSCs的成脂分化，抑制成骨分化。

有文献指出Wnt/β-catenin信号通路在MSCs的增殖和分化过程中起到重要的作用[12,13]，本实验结果表明不同浓度淫羊藿苷在刺激MSCs后激活了Wnt/β-catenin信号通路，提高了其活化标志蛋白β-catenin和Wnt7的表达，而抑制了降解蛋白GSK-3β的表达，说明不论是10 ng/ml还是40 ng/ml淫羊藿苷均可以激活Wnt/β-catenin信号通路。Wnt/β-catenin通路抑制实验结果显示，Wnt/β-catenin信号通路特异性小分子抑制剂PNU-74654阻断Wnt/β-catenin信号通路后，淫羊藿苷对MSCs的成骨和成脂分化干预均被显著阻断，但不能够完全阻断。本研究结果中，10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷均可激活Wnt/β-catenin信号通路，但是却诱导MSCs出现相反的分化方向，出现这种现象的具体机制又如何，这将是我们下一步的研究重点。