高通量测序在鸟类肠道微生物中的研究进展

刘 倩，宋文涛，樊国印，熊衍文，陈海婴1,，吴 葵

在脊椎动物中，鸟类是地球上最普遍存在的物种之一，拥有超过10 000个现存物种，也是最多样化的物种之一[1]。鸟类的分布遍及全球，每年数以亿计的鸟类在各个大洲之间持续流动，它们能够跨越生物和地理的边界，在广阔的地理空间范围内迁徙[2]。鸟类可以通过直接传播，或作为病原体的载体，例如禽类病原体和人兽共患病病原体，也可以传播抗生素耐药性细菌，成为许多人类和动物疾病的感染来源[3-4]。候鸟在迁徙过程中的觅食、排泄等行为，使其更可能成为寄生虫或其他微生物跨地域传播的带菌者和传播者。由于这些特点，鸟类在微生物的传播过程中起着重要的作用，从而影响微生物的动态，影响各种病毒和细菌的生态和进化[5]。

目前我们对鸟类肠道微生物的研究十分有限，且主要集中于一些人工养殖的经济物种，如家鸡、火鸡、家鸭和鸵鸟等，野生鸟类则相对较少。早期人们对肠道微生物的研究主要通过直接从PCR扩增子构建克隆文库进行测序，或通过指纹图谱分析[6-7]。相对于高通量测序(High-throughput sequencing，HTS)，如454焦磷酸测序和Illumina测序平台[8]，克隆测序和指纹技术通量低且耗时长。近年来，测序技术的进步使人们对人、鼠等哺乳动物肠道微生物的认识快速提升，但对鸟类肠道微生物的研究相对滞后。本文在简要介绍高通量测序技术的基础上，综述了其在鸟类肠道微生物研究中的进展。

1 描述鸟类肠道微生物的测序策略

1.116S rDNA测序 16S rDNA 测序技术是用于常规微生物组分析的最重要的不依赖于培养的方法之一。16S rDNA是原核生物染色体中编码核糖小亚基的DNA序列，人们根据其序列变异特点将其分为9个可变区和10个保守区[9]，其中保守区序列反映了物种间的亲缘关系，而可变区序列则能体现物种间的差异。针对16S rDNA测序，主要有两种方法：一种是以454焦磷酸测序和Illumina为代表的二代测序技术，但是受测序长度的限制，往往只能选择1～3个可变区作为扩增片段(目前鸟类肠道菌群研究常用扩增子片段是V3～V4区)，但分类的准确性和一致性存在问题。另一种则是以PacBio和Nanopore为代表的三代测序技术，可以得到16S rDNA基因全长序列，相对于二代测序，其检测到的物种多样性和生态结构的复杂度更高且更准确，但测序成本相对较高且存在一定的测序错误率[10]。

1.2宏基因组测序 宏基因组学(元基因组学，Metagenomics)[10]是指应用高通量测序技术对样品中存在的全部DNA含量进行测序，而与来源无关。目标样品中包含的模板DNA可直接进行测序，而无标记基因扩增步骤。宏基因组学不仅能够提供关于鸟类肠道内病毒的信息，而且能够对宿主线粒体DNA进行表征，从而识别宿主物种，指示饮食偏好，并从新鲜的粪便样本中识别细菌种群。与16S rDNA测序相比，宏基因组学方法的主要优势在于能够将微生物组中的细菌表征为“种”水平。此外，宏基因组学还提供了有关整个基因库、基因组结构和组织、微生物群落结构和样品中存在的进化关系的全面信息。因此，与16S rDNA标记基因方法相比，宏基因组测序具有明显的优势。宏基因组方法的主要挑战是生成的序列数据量大。与基于16S rDNA的方法相比，这种方法成本较高。此外，数据分析需要一定的生物信息学基础以及长期的经济投资，而这只有在专业实验室才有可能实现。由于目前仍缺乏专门设计的参考数据库，使得在尝试常规提取生物学信息时使用该技术具有挑战性。

1.3宏转录组测序 宏转录组学(Metatranscriptomics)[11]是特定时期环境样本、组织样本中所有的微生物的RNA(转录本)的集合。通过对这些转录组进行大规模高通量测序，可以直接获得环境中可培养和不可培养的微生物转录组信息。这项技术除了可以区分微生物群落中的活菌群外，还可以对微生物群落中不同的细菌成员进行功能表征。在复杂的微生物样品中，不同的微生物群落会相互作用，从而降解、破坏或发酵基质的有机成分。对这些样本中纯化的RNA进行测序将提供相关细菌群落如何相互作用的基本描述。然而宏转录组学也有一定局限性。首先，很难从环境样品中获得高质量和足量的RNA；其次，将目标mRNA与高丰度的RNA类型(例如rRNA)分开是一个挑战；第三，mRNA的半衰期短导致难以做到对环境变化的快速和短期响应；第四，参考数据库不足[12]。

2 高通量测序技术在鸟类肠道微生物研究中的应用

2.1揭示鸟类肠道菌群的多样性 高通量测序技术在鸟类肠道菌群中的应用尚处于起步阶段，较早的报道见于2013年对鸸鹋盲肠菌群的多样性研究[13]。鸟类的消化道由食道、嗉囊、腺胃(前胃)、肌胃(砂囊)、小肠、盲肠、结肠、泄殖腔组成，其核心微生物主要由4个门构成：厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)[14]。与哺乳动物相比，鸟类的胃肠道相对较短，消化过程需要不到3.5小时，这使其形成一个具有很强选择性和适应性的微生物组。Bodawatta等人[15]利用高通量测序发现了新几内亚雀形目鸟类消化道微生物菌群的差异。这些差异与鸟类的食性(食虫或杂食鸟类)有关。相比之下，在野生红嘴鸦的研究中，口咽、消化道、小肠和大肠4个部位的优势菌门的相对丰度之间没有发现明显的差异。此外，这4个消化道部位中的菌群多样性和丰富度指数也没有发现显著差异[16]。

在脊椎动物中，哺乳动物的饮食和宿主系统发育地位驱动着肠道菌群变化，但这种驱动模式是否适用于所有鸟类尚不清楚。随着高通量技术的发展，发现了一系列影响鸟类肠道微生物组成和多样性的因素。例如Dong等人[17]通过16S rDNA的高变区V3～V4测序，对不同地区的白头鹤肠道菌群多样性的研究发现在不同的取样地点和越冬期白头鹤肠道细菌群落结构和多样性存在显著差异，而环境因素可能是影响肠道菌群组成的重要因素。除此之外，Bodawatta等人[15]也发现宿主饮食与宿主系统发育对鸟类肠道菌群均有一定影响，但宿主饮食的影响似乎更大。最近一项研究[18]纳入了315种哺乳动物和491种鸟类，分析发现鸟类和能飞行的哺乳动物—蝙蝠的菌群组成相似性高，在不具备飞行能力的哺乳动物中，饮食和短期进化亲缘关系驱动着肠道菌群组成变化，但鸟类和飞行类哺乳动物—蝙蝠打破了这种模式，提示飞行的适应性或破坏了宿主和微生物之间长期存在的共进化关系。由此可见，鸟类的物种丰富，生活史特征多种多样，需要纳入更多、更广泛的个体来评估环境、宿主、飞行等因素对鸟类肠道菌群的影响。

2.2研究抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes，ARGs) 近年来，许多细菌感染变得越来越难以治疗，部分原因是由于人类病原体对抗生素的耐药性增加。最近的研究表明，环境和野生动物都是抗性基因多样性的主要来源和宿主[19]。鸟类的生态位多样化且容易接触到人类和环境中的细菌，成为包括病原体在内的不同细菌物种的带菌者和传播者，且可能远距离传播含有抗生素抗性基因的病原体[20-21]，这在一定程度上可能导致了耐药基因在细菌间的扩散和传播。最近一项研究发现，鸟类肠道菌群中的ARGs类型几乎对临床和农业常用的所有主要抗生素类别都具有耐药性[22]。因此，进行特定系统的整个微生物群对抗生素耐药性的研究是很重要的。

虽然对鸟类抗生素的大多数研究都是基于体外培养的细菌，但高通量测序技术的发展极大地扩展了我们对环境中耐药基因库的认识。整个转录组的基因测序(即宏转录组)对于抗生素耐药性基因的研究具有很多优点。因为宏转录组可以从整个微生物群落获得数据，尤其是功能活跃的基因，而非必需的基因往往会丢失[23]。Marcelino等人[24]应用宏转录组学对110只鸟类的粪便样本进行了研究，评估澳大利亚水鸟和南极洲企鹅的肠道微生物组中转录的ARGs的多样性和丰富性。研究发现即使在澳大利亚和南极洲等偏远地方的鸟类也具有广泛的抗生素耐药性，并且与人类废弃物接触(即使经过污水处理)似乎会影响禽类野生生物对ARGs的获取。以高通量测序技术为基础的宏转录组学是一项强大的工具，即使目前相关文库的数量相对较少，也有可能在不同地区的鸟类之间进行有意义的比较，从而为将来的研究提供指导。

2.3发现鸟类携带的病原微生物 鸟类是许多新发传染病和人兽共患病病原体的宿主，其体内外经常带有一些病原微生物，包括禽流感病毒、沙门氏菌、弯曲菌、西尼罗病毒等[25-27]。不论是人兽共患病或是动物源性传染病均为威胁人类健康的重大隐患，威胁着全球公共卫生安全。高通量测序可以帮助快速识别特定样本中存在的致病菌和病毒，这在一定程度上提高了我们对病原微生物多样性和进化的了解，并有助于估计对家禽或人类的潜在风险，为病原体的鉴定、人类传染病的诊断提供帮助[28-29]。

高通量测序在鉴定未知病原微生物方面具有巨大的优势。孟祥莉等人[30]利用 PacBio RS Ⅱ 三代高通量测序技术获得近似16S rRNA基因全长序列，分析得到青藏高原秃鹫肠道中已知种的102个OPUs，有45个OPUs为人临床样本中分离的病原菌或者引起过人类疾病暴发的病原菌，例如类志贺邻单胞菌、梭状芽胞杆菌、产气荚膜梭菌、溶血葡萄球菌以及泡囊短波单胞菌等，其中致病性产气荚膜梭菌在秃鹫的肠道菌群中丰度最高，此外还从秃鹫的粪便中分离得到了3株可能具有致病性的放线菌。Truchado等人[31]利用病毒宏基因组学(Virome)首次在一个偏远地区的野生鸟类种群中检测到了一种新的Gyrovirus—GyV11，粪—口途径可能是Gyrovirus的主要传播途径，但其在禽类中的致病机理，是否可以感染人或鸡，尚需要进一步研究。以上研究均表明高通量测序对阐明病原微生物的结构和起源、理解病原感染可能如何影响鸟类种群的健康以及鸟类作为可能感染其他动物物种病原的潜在来源都十分重要。

此外，高通量测序的发展，促进了病毒学的研究从传统简单的单宿主、单病毒发展为多宿主、多病毒的研究，使得探索野生鸟类中决定病毒群落结构的因素成为可能。关于鸟类目Anseriformes和Charadriiforme的研究则很好的证明了这一点。Wille等[32]通过宏转录方法描述了隶属于这两种鸟类目中9种鸟类的病毒组特征，鉴定出27种病毒，其中有24种是新病毒。在这些样本中病毒丰度、α多样性等存在着大规模的异质性以及一定程度的连通性，并且宿主生态学的各个方面，如觅食生态学在塑造病毒组组成方面可能比宿主分类学更为重要。另一项研究[33]中也表明，相较于宿主分类学，感染甲型流感的状态、地理位置等似乎对鸟类中病毒组的丰度及多样性的影响更大，即在病毒组结构方面，宿主生态学可能比宿主分类学起到更为重要的作用。

3 结语与展望

基于高通量测序技术的16S rDNA测序、宏基因组学和宏转录组学等，给微生物研究带来了革命性的变化，也推动了鸟类肠道微生物的研究。未来随着高通量测序的成本进一步降低、生物信息学分析技术提高以及广泛推广，其将在鸟类肠道菌群、ARGs以及鸟类相关病原微生物等领域取得更为显著的成果，对新发传染病发现及溯源、人畜共患病的防控和ARGs监测等具有重要指导意义。

利益冲突：无