组蛋白脱乙酰酶6脱乙酰催化域的底物蛋白及功能*

张 斌， 见文成， 蒋 凡

（山东大学齐鲁医学院 1基础医学院药理学系，2齐鲁医院放射科，3教育部和国家卫计委心血管重构和功能研究重点实验室，山东济南250012）

蛋白质的乙酰化修饰是蛋白功能调节的重要机制，影响细胞增殖、迁移、凋亡等多方面功能。靶蛋白的乙酰化状态受组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylases，HDACs）和组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferases，HATs）的共同调节。乙酰化和脱乙酰化状态失衡可影响细胞正常的生命活动。HDACs通过对组蛋白及某些非组蛋白的赖氨酸（lysine，Lys）残基脱乙酰化修饰，调控细胞的病理生理过程，参与多种疾病的发生发展。目前，在哺乳动物细胞中已发现了 18 种 HDACs，根据特性分为 4 类:I 类包括HDAC1、2、3 和8，主要使组蛋白脱乙酰化；II 类包括HDAC4、5、6、7、9 和10，与非组蛋白脱乙酰作用密切相关，被进一步分为 IIa（HDAC4、5、7、9）和 IIb（HDAC6、10）2 个亚类；III 类包括SIRT1～7，主要作用于非组蛋白底物；IV 类包括HDAC11。大量研究表明，HDACs 各亚型在不同疾病状态下发挥不同功能，因此，明确HDACs 亚型的特点对于了解疾病的发生机制及特异性药物的研发具有重要意义。

HDAC6 属于IIb 类HDACs，是家族中最大的亚型，含1 215个氨基酸残基，分子量约131 kD，酶活性依赖 Zn2+。HDAC6 结构独特［1］，包含 1 个核定位信号区（nuclear localization signal，NLS）、2 个保守的富含亮氨酸的核输出信号区（nuclear export signal，NES）NES1 和NES2、8 个连续的含丝氨酸-谷氨酸的十四肽（Ser-Glu-containing tetradecapeptide，SE14）重复序列、2 个串联的脱乙酰催化域（deacetylase catalytic domain，DD）DD1 和DD2、1 个锌指泛素结合结构域（zinc-finger ubiquitin-binding domain，ZnF-UBP）及1个动力蛋白马达结合域（dynein motor binding domain，DMB）。虽然结构中存在NLS，但是在NES 和SE14的作用下，HDAC6主要定位于胞浆中。DD1和DD2 是HDAC6 的酶活性区域，均有使底物蛋白脱乙酰化的活性，其中DD2 的功能特征较为明确，是HDAC6 选择性抑制剂的作用靶位［2］。ZnF-UBP 和DMB 是HDAC6的非酶活性区域，可以与泛素化的错误折叠蛋白结合，在动力蛋白作用下沿微管至聚集体，促进包涵体形成，经自噬系统清除毒性蛋白。

基于HDAC6 的结构特征，已有多个HDAC6 抑制剂被发现。这些抑制剂的化学结构包含帽基团（cap group）、连接区（linker）及Zn2+结合基团（zincbinding group）3 个部分。帽基团是HDAC6 抑制剂的表面识别区，与HDAC6 酶活性区域的底物结合区相结合，Zn2+结合基团螯合酶活性部位的Zn2+，抑制酶的活化。一些异羟肟酸类小分子化合物虽无帽基团，但其α 位的sp2杂化碳结构也可有效抑制HDAC6的酶活性［3］。目前HDAC6 抑制剂仅作用于HDAC6的酶活性区域，抑制其脱乙酰活性，而对ZnF-UBP 和DMB 等非酶活性区域无显著影响，这与HDAC6基因的沉默或敲除是不同的，后者影响到了HDAC6 的所有功能［2］。近年来，HDAC6 抑制剂在恶性肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病等疾病治疗方面均显示出广阔的应用前景，表明HDAC6 的脱乙酰活性及其底物蛋白的乙酰化稳态对机体病理生理功能的调节至关重要。HDAC6 已被证实可影响多个底物蛋白的乙酰化水平，包括微管蛋白（tubulin）、热休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）、皮层肌动蛋白结合蛋白（cortical actin-binding protein，cortactin）等。本文将对HDAC6 的脱乙酰底物及其功能的研究进展进行综述。

1 tubulin

tubulin 是 HDAC6 的主要底物蛋白，是第 1 个得到鉴定的可被乙酰化调节的胞浆蛋白，从而改变了传统的观点——即乙酰化功能只是修饰细胞核内组蛋白而影响转录。tubulin 包含两种类型:α-tubulin和β-tubulin，二者结合形成二聚体作为微管组装的亚基。在真核生物中，微管是细胞骨架的主要成分，对于维持细胞形状、物质转运、细胞运动、DNA 分离等都起到了不可或缺的作用。在微管形成过程中，tubulin 的翻译后修饰，如乙酰化、磷酸化、泛素化等，对于微管的性能及细胞功能的调节都至关重要。tubulin 乙酰化水平受 α-tubulin 乙酰转移酶 1（α-tubulin acetyltransferase 1，ATAT1）和 HDAC6 的调控，维持动态平衡。乙酰化的tubulin有助于维持微管的稳定性，是微管稳定的标志；HDAC6 过表达则可使tubulin 脱乙酰化，从而降低微管稳定性，增加细胞运动［4］。tubulin 乙酰化在多种细胞生命活动中均发挥作用，例如可以使细胞免受H2O2、KCl、紫外辐射等刺激诱导的细胞死亡，调控应激反应［5-6］。自噬体与溶酶体的融合也需要乙酰化的tubulin 来参与［7］。研究人员还发现小鼠脑中乙酰化tubulin 富集，tubulin 乙酰化缺失则可致脑发育异常、智力障碍，提示tubulin乙酰化在维持学习记忆等高级神经活动中具有重要作用［8］。因此，作为调控tubulin 乙酰化水平的关键酶，HDAC6的作用也就尤为重要。

研究表明，tubulin 乙酰化的失衡与神经系统疾病、肿瘤、心脏病等多种疾病密切关联。在一项关于进行性神经性腓骨肌萎缩症的研究中，实验人员发现模型小鼠出现tubulin脱乙酰化、轴突运输缺陷，而HDAC6 抑制剂可以减轻这种症状［9］。而且，在帕金森病［10］、肌萎缩侧索硬化症［11］、阿尔茨海默病［12］等中枢神经退行性疾病中，抑制HDAC6 所发挥的保护作用都与增加tubulin 乙酰化、改善轴突运输有关。tubulin 乙酰化的状态还关系着多种肿瘤的发展转归。例如，tubulin 乙酰化是头颈部鳞状细胞癌的预后标志［13］，可抑制肿瘤细胞上皮-间充质转化，提高微管稳定性，从而减少癌细胞的侵袭和转移［14］。在原发性乳腺肿瘤中，tubulin 乙酰化可增加疾病进展或死亡的风险［15］。此外，tubulin 乙酰化状态与心脏疾病亦有关，脱乙酰化可促进蛋白质毒性，诱发小鼠心肌病，而HDAC6抑制剂则可减缓这种病理过程［16］。

2 HSP90

HSPs 是一类高度保守的分子伴侣，是第2 种被鉴定的HDAC6 底物蛋白，当宿主受到高温、缺氧、病原体等刺激时 HSPs 合成增加［17］。HSPs 的主要功能包括蛋白质激活、分子复合物的组装和解聚、与泛素-蛋白酶体协同调节错误折叠蛋白的降解等。按照分子量的不同，HSPs分为6类，其中HSP90的含量尤为丰富，以二聚体形式存在。作为分子伴侣，HSP90 的活性依赖ATP，以分子伴侣复合物（含多种辅助分子伴侣）的形式与数以千计的蛋白质产生相互作用，广泛参与细胞生命活动。HSP90 的功能受HDAC6 酶活性的调节［18］。脱乙酰化的 HSP90 驱动客户蛋白（client protein）复合体的形成，而HDAC6抑制剂增加HSP90乙酰化，降低其分子伴侣活性，使其结合ATP 的能力降低，与客户蛋白及辅助分子伴侣的相互作用减弱，从而抑制客户蛋白的成熟［19］。客户蛋白，也称为顾客蛋白，是一系列底物蛋白（substrate protein），广泛参与调控细胞存活、增殖和凋亡，在细胞信号转导及稳态维持方面发挥重要作用。目前已有200 多个HSP90 的客户蛋白得到确认。研究表明，HSP90 可调控血管形成因子如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及抗凋亡因子如Akt的稳定性，脱乙酰化的HSP90可使这些蛋白的稳定性增强，促进血管形成和细胞存活［20-21］。雄激素受体、糖皮质激素受体等类固醇激素受体的功能也受HSP90 乙酰化状态的影响，乙酰化的HSP90 引起共伴侣分子的解离，使配体与激素受体的结合减少，破坏受体的核转位，而脱乙酰化的HSP90 则促进受体的成熟［22-23］。HSP90 乙酰化还可增加调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）的免疫抑制活性，维持免疫稳态，反之则易引起自身免疫病、移植排斥的发生［24］。此外，HSP90 乙酰化可限制甲型流感病毒入核，抑制病毒复制而干扰其生命周期［25］。缺氧诱导因子 1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）也受HSP90 乙酰化状态的调节，高乙酰化可降低HIF-1α的稳定性［26］。

乙酰化削弱了HSP90 与客户蛋白的相互作用，极大的影响了客户蛋白的生物活性。因此，HSP90的功能与多种疾病的发生发展息息相关。HSP90 的客户蛋白包括多种致癌蛋白（如DNA 甲基转移酶1）和抗凋亡蛋白（如Akt），HSP90 与这些蛋白结合形成复合体，防止它们降解，从而促进肿瘤发生。而HDAC6 抑制剂增加HSP90 乙酰化，使复合体解离，DNA 甲基转移酶1 等在泛素-蛋白酶体的作用下降解，引起细胞凋亡，从而在癌症治疗中发挥有益作用［27］。此外，HSP90 乙酰化状态在其他疾病中的作用也有报道:Gaucher 病是一种常染色体隐性遗传病，患者葡萄糖脑苷脂酶（glucocerebrosidase，GCase）活性缺失，造成葡萄糖脑苷脂在巨噬细胞溶酶体中贮积，受累组织器官出现病变；GCase 可被HSP90 识别结合并通过相关途径降解，而乙酰化的HSP90 与GCase 的结合力降低使GCase 的寿命延长，从而利于其活性的发挥，改善葡萄糖脑苷脂的代谢［28］。

3 cortactin

肌动蛋白（actin）是细胞骨架微丝的主要成分，以肌动蛋白单体（G-actin）和由单体组装而成的纤维状肌动蛋白（F-actin）两种形式存在。除actin 外，还有其他蛋白参与微丝的结构功能，cortactin 就是一种微丝肌动蛋白结合蛋白，通过调控微丝的聚合参与多种细胞活动，如突触形成、囊泡运输、细胞黏附、细胞侵袭、细胞迁移、细胞分裂等。cortactin 的功能受乙酰化等翻译后修饰的调节。在HDAC6 作用下，cortactin 脱乙酰化可增加其与F-actin的相互作用，从而促进F-actin 的聚合和纤毛吸收，导致细胞纤毛缩短、丢失［29］。cortactin 的脱乙酰化有助于与 actin 的结合，促使细胞形成伪足，增加基质金属蛋白酶的胞膜输送，在肿瘤细胞的侵袭和迁移中具有重要意义［30-31］。脱乙酰化的cortactin 对于内皮细胞的迁移和发芽也是必不可少的［32］。Yan 等［33］在一项巨噬细胞的研究中发现，在炎症信号刺激下，HDAC6 可转移到细胞外围，使cortactin 和tubulin 脱乙酰化，从而增强actin 的装配及微管运动，这些细胞骨架动力学的变化进而促进了巨噬细胞的浸润和吞噬反应；而HDAC6 缺乏时，巨噬细胞对炎症信号则变得不敏感。

cortactin 的脱乙酰化调节在疾病发生发展中的作用已有诸多报道。纤毛作为细胞附属物，在感知和传导环境信号、组织发育、稳态维持方面均发挥作用。cortactin 的脱乙酰化导致纤毛功能异常，与Bardet-Biedl 综合征、多囊肾、慢性阻塞性肺气肿等纤毛病变有关，而HDAC6 抑制剂则可减轻纤毛功能的损失［34］。cortactin 脱乙酰化可激活内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），增强内皮细胞NO 生物活性，保护血管功能，从而对抗动脉粥样硬化病变［35］。cortactin 的乙酰化则可造成促性腺激素释放激素表达神经元迁移受损，导致性机能减退［36］。此外，脱乙酰化的cortactin还可促进白血病淋巴细胞的浸润迁移，为白血病的诊治开辟了新的思路［37］。

4 过氧化氧化还原蛋白（peroxiredoxin，Prx）

Prx 是一类抗氧化蛋白，广泛存在于生物体中，哺乳动物的Prx包括Prx1、2、3、4、5、6，在消除活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的过程中具有重要作用。研究表明，Prx亚型在阿尔茨海默病、皮克病、帕金森病等疾病中存在异常表达，其磷酸化、亚硝基化等改变均造成酶活性的丧失。近年来Prx 的乙酰化修饰受到愈来愈多的关注。Parmigiani 等［38］在实验中发现Prx1及Prx2是HDAC6的特异性底物，乙酰化Prx1 及Prx2 的抗氧化作用显著增强，可提高细胞存活率，而脱乙酰化Prx1 及Prx2 的抗氧化能力大大降低，细胞死亡率增加，提示Prx1及Prx2的乙酰化在抗氧化应激损伤中具有重要作用。

一项关于阿尔茨海默病的研究显示，病人脑组织中Prx1 乙酰化水平降低，原代培养的海马神经元在 Aβ 作用下 Prx1 乙酰化水平也降低，而 HDAC6 抑制剂可以增加Prx1乙酰化，继而减少ROS的生成，改善线粒体轴突运输，减轻病理损伤［39］。Janina等［40］在进行遗传性失明的研究中发现，Prx1 的过氧化物还原活性与其乙酰化程度相关，HDAC6 抑制剂tubastatin A 可以逆转Prx1 的脱乙酰化，阻止酶活性的灭活，从而保护感光细胞，在斑马鱼模型中具有显著的视觉保护功能。Jian 等［41］在6-羟基多巴导致的帕金森病动物模型中也发现小鼠纹状体中Prx1及Prx2乙酰化水平降低，抗氧化作用减弱，ROS 消除受抑，而HDAC6 抑制剂可以明显增加其乙酰化，减轻氧化损伤及多巴胺能神经变性。另有研究报道，在HDAC6 抑制剂的作用下，Prx1 乙酰化还可以减轻心肌缺血再灌注损伤［42］。这些结果均表明Prx1和Prx2的乙酰化状态可以调控多种疾病的病理过程。

5 Ku70

Ku70 是Ku 蛋白的亚单位之一，分子量约为70 kD，作为一种DNA末端连接蛋白，在DNA复制、DNA修复、转录调控、端粒结构的维持等细胞活动中发挥重要作用。Ku70 在乳腺癌、宫颈癌等肿瘤组织中高表达，与恶性肿瘤的发生发展密切相关。研究表明，Ku70 的功能受HDAC6 调节，乙酰化状态决定其在DNA 修复中的作用。Chaudhary 等［43］报道，核基质结合区结合蛋白Smar1 通过HDAC6 介导Ku70 脱乙酰化，并使其向DNA 双链断裂位置募集，在电离辐射诱导的DNA 损伤中促进DNA 的有效修复，减少细胞凋亡。Boucherat等［44］在一项肺动脉高压的研究中发现低乙酰化的Ku70可以阻止促凋亡蛋白Bax向线粒体易位，抑制凋亡，促进血管平滑肌细胞增殖和血管重构，加重肺动脉高压的进展，而HDAC6 抑制剂可提高Ku70乙酰化水平，引起Bax易位，促进线粒体膜去极化及细胞凋亡，从而减轻肺动脉高压的症状。Ku70 还具有去泛素酶活性，在胞浆内可与泛素化的Bax或抗凋亡蛋白c-FLIP等结合形成复合体，阻止它们被蛋白酶体降解，在HDAC6 抑制剂的作用下，Ku70 乙酰化水平升高，复合体解离，导致Bax 激活、c-FLIP 降解，从而诱导细胞凋亡，在杀伤肿瘤细胞过程中发挥有效作用［45］。

6 其他

HDAC6 的脱乙酰催化底物还有 p53、Akt、βcatenin 等。p53 是一种抑癌蛋白，具有转录因子活性，参与调控细胞稳态，抗肿瘤形成。p53 羧基末端Lys 残基（Lys120、Lys164、Lys370、Lys372、Lys373、Lys381、Lys382和Lys386）的乙酰化修饰是其行使正常生理功能的重要机制［46］。脱乙酰化p53 的转录因子活性受到抑制，从而促进细胞生长，抑制凋亡，诱发肿瘤；而乙酰化 p53 的转录活性增强，发挥抗肿瘤作用［47］。Akt 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，调节细胞增殖、基因转录、迁移、葡萄糖代谢等活动。Iaconelli 等［48］研究发现，在人神经前体细胞（human neural progenitor cells，NPCs）中，Akt 激酶活性受 HDAC6 的调控，二者相互作用，使Akt 结构域的Lys163和Lys377脱乙酰化，而在HDAC6 抑制剂的作用下，Akt乙酰化水平升高，与三磷酸肌醇结合减少，Akt激酶活性减弱，从而降低靶蛋白磷酸化水平，调节神经元的分化。βcatenin 是钙黏蛋白复合体的亚基，主要位于胞膜，在病理生理因素的诱导下可以从复合体中脱离进入胞核，参与基因表达，调节细胞增殖、分化及凋亡。βcatenin 的核转位是Wnt 信号通路活化的一个标志，与多种癌症相关［49］。研究表明，乙酰化 β-catenin 的核转位受到抑制，影响其对基因表达的调控作用。Li 等［50］报道，在表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）的刺激下，β-catenin 的 Lys49在 HDAC6 的作用下脱乙酰化，从而促进β-catenin 核转位，使c-Myc 表达增加；而 HDAC6 失活使 β-catenin 乙酰化水平升高，能够阻断EGF诱导的β-catenin核转位，继而降低c-Myc的表达，抑制肿瘤细胞的增殖。

7 小结

综上所述，HDAC6 脱乙酰作用的研究已取得了一些成果，但是如何恰当地进行干预仍是亟待解决的问题。例如，HDAC6 底物众多，各底物均具有数目不等的Lys 残基，如何更精准地确定脱乙酰位点；DD1 和DD2 的底物是否具有差异；是否还有其他尚未发现的底物蛋白；影响脱乙酰活性的信号通路有哪些，等等。总之，HDAC6 脱乙酰作用对于机体病理生理功能的调节已引起学界的广泛关注，深入研究其生物学机制，明确底物调控的细节和临床意义，将有助于发展围绕HDAC6 脱乙酰催化作用的治疗策略。