训练免疫在动脉粥样硬化中的作用*

陈馨浓， 葛其卉， 赵一璇， 郭晓辰， 张军平

（天津中医药大学第一附属医院，天津300381）

1 概述

训练免疫是指固有免疫细胞［包括单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞（dendritic cells，DC）等］接受抗原刺激后产生免疫记忆，当再次受到相同或不同刺激时，产生更加强烈的免疫应答［1-2］。作为一种新的免疫模式，训练免疫与适应性免疫记忆不同。适应性免疫记忆是由T 和B 淋巴细胞诱导的长期记忆，该过程对所涉及的抗原具有高度特异性，并由V-D-J基因重组介导；训练免疫由固有免疫细胞诱导，持续时间较短，且训练免疫通常为非特异性，免疫反应增强与细胞内代谢和组蛋白修饰水平的表观遗传调控有关，并不涉及基因突变和重组［3］。

组蛋白修饰是训练免疫的核心机制；此外，DNA甲基化及微小RNA（microRNA，miRNA）和（或）长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）表达调控可能发挥一定作用［4］。这些转录程序的变化不仅使细胞内的免疫信号重新连接，而且诱导细胞代谢从氧化磷酸化向需氧糖酵解转变，从而提高对刺激的反应能力［2］。虽然训练免疫为机体的一种适应性反应，但当其被不适当地激活时，可诱导慢性炎症反应，加剧组织损伤［1］。

2 训练免疫与动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的相关性

AS 是缺血性心血管疾病的主要病理基础，其特征是脂质代谢失衡和动脉壁炎症反应。脂质和免疫细胞之间的相互作用是促进AS 病程中慢性炎症的主要因素，其中氧化型低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein，ox-LDL）和单核/巨噬细胞是关键［5］。最近研究发现训练免疫与AS 关系密切，主要表现为单核/巨噬细胞受到ox-LDL 刺激后，通过细胞内代谢和表观遗传重组，诱导长期的促炎表型［4，6］。因此，靶向干预训练免疫相关单核/巨噬细胞功能、减少ox-LDL 的影响或调整训练免疫机制可能成为恢复AS免疫稳态的有效策略。

2.1 单核/巨噬细胞与训练免疫的关系 单核/巨噬细胞作为AS 病变中最丰富的免疫细胞，可以协调脂质代谢和炎症反应，对于调控斑块的形成和稳定性具有决定性作用［7-8］。当单核细胞接受刺激诱发训练免疫时，可诱导促炎基因活化及细胞因子生成，在此过程中促炎细胞因子的表观遗传修饰起重要作用［6］。此外，经过训练的单核细胞和巨噬细胞可促进糖酵解并增加谷氨酰胺分解，进入三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环，其中间代谢物共同调节表观遗传相关酶的活性，最终通过激活组蛋白标记并增加染色质可及性（chromatin accessibility），长期诱导促炎基因转录［9-10］。临床研究同样发现，有症状的AS 患者的循环单核细胞具有促炎表型，且糖酵解酶表达增加，这些变化与组蛋白甲基化水平的表观遗传重塑相关［11］。

值得注意的是，训练免疫造成AS 的不利影响不仅限于产生促炎细胞因子，还包括编码基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）基因的表观遗传重编程增加了斑块破裂的易损性、清道夫受体（scavenger receptor，SR）参与泡沫细胞形成、趋化因子负责招募循环免疫细胞等［12］。目前，关于AS 相关训练免疫的体外研究主要集中在单核/巨噬细胞分化方面，即了解单核细胞向巨噬细胞分化之前和分化过程中如何积累免疫记忆［13］。总之，在AS 背景下，针对单核/巨噬细胞的训练免疫机制，可开发防治疾病的新药理靶点。

2.2 ox-LDL 与训练免疫的关系 早先研究报道微生物及其产物（包括白色念珠菌或β-葡聚糖）是诱导训练免疫的刺激源。后来Bekkering 等［14-16］通过研究发现，在没有持续感染的情况下单核/巨噬细胞的训练免疫也可被诱导，即ox-LDL 可通过组蛋白修饰诱导巨噬细胞长时间的促炎表型。ox-LDL是一种损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），与髓细胞表面受体CD36 结合，能够使促AS 细胞因子和趋化因子［包括白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和单核细胞趋化蛋白 1］产生增加［15，17］。另外，在训练免疫的单核细胞中 MMP2 和MMP9 的mRNA 表达显著增高，增加了斑块的易损性；SR-A 和CD36的表达增高，而胆固醇流出转运蛋白ATP 结合盒转运体A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）和ABCG1 的表达降低，从而促进泡沫细胞形成［18-20］。总之，ox-LDL 作为AS 相关的内源性无菌化合物，是促进单核/巨噬细胞训练免疫的重要刺激源，而天然LDL 无法在体外诱导训练免疫［15］。

通路分析显示，ox-LDL 诱导的训练免疫依赖于Toll 样受体2（Toll-like receptor 2，TLR2）和TLR4，以及细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和磷 脂 酰肌醇 3-激酶 的 激活［15］。Sohrabi 等［21］研究表明哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）依赖性活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的产生控制了ox-LDL 诱导人单核细胞来源巨噬细胞的训练免疫表型。药理学调节相关通路可能为治疗AS 过程中单核细胞异常活化诱导的慢性炎症提供了一种潜在方法。

2.3 炎性体（inflammasome）激活在训练免疫中的作用 炎性体激活与AS 关系密切。最近有关炎性体通路的代谢调控和固有免疫的研究也逐渐受到重视［22］。斑块巨噬细胞中细胞代谢紊乱多数与含pyrin结构域的核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎性体活化有关，包括释放溶酶体组织蛋白酶、线粒体ROS、细胞外ATP 等［23］。一项关于功能性训练免疫的数量性状位点分析研究表明，参与IL-1β信号传递的含胱天蛋白酶募集结构域凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）和IL-1受体辅助蛋白（IL-1 receptor accessory protein，IL1RAP）的单核苷酸多态性与ox-LDL 诱导训练免疫的能力显著相关［24］。事实上，IL-1β 对调控表观遗传重编程至关重要［25］。炎性体是调节IL-1β 成熟和释放机制的核心。Duewell 等［26］的离体研究表明胆固醇晶体激活巨噬细胞中的NLRP3 炎性体。ox-LDL摄取增加可通过CD36导致细胞内胆固醇晶体成核，破坏溶酶体稳定性，从而降低胆固醇和脂肪酸的新陈代谢，并且激活NLRP3炎性体，产生IL-1β［27］。

为了证明诱导训练免疫是否需要NLRP3 炎性体，Christ 等［28］进行了相关研究，发现喂养西方饮食可促进低密度脂蛋白受体敲除（low-density lipoprotein receptor knockout，LDLR-/-）小鼠髓系祖细胞的表观遗传和转录重编程，诱导单核细胞促炎表型，且这些变化在小鼠换回常规饮食后仍然存在，所涉及的表观遗传修饰依赖于NLRP3 炎性体激活及IL-1β 分泌。这一研究结果表明新陈代谢、表观遗传重编程和炎性体之间存在交叉对话，共同驱动高脂饮食诱导的训练免疫［24］。然而饮食诱导的训练免疫是否直接影响斑块形成仍未被证实，针对二者相关性的研究对于确认训练免疫影响AS 形成的机制至关重要，需要进一步探索［13，29］。尽管高胆固醇促进单核细胞训练免疫，但使用他汀类药物降脂并不会逆转这种促炎表型［30］。需要注意的是，在高脂或高胆固醇环境下，固有免疫训练不仅在循环单核细胞中发生，也可见于骨髓祖细胞，其中髓样前体细胞的长期表观遗传重编程，确保了固有免疫细胞长时间过度活化，促进AS发展［31-32］。研究发现骨髓细胞中胆固醇的积累可以激活NLRP3炎性体，增加AS斑块内中性粒细胞积累和网状病变数量［33］。此外，与AS 相关的醛固酮水平升高，可通过上调表观遗传介导的脂肪酸合成，诱导单核/巨噬细胞训练免疫［34］。

ox-LDL 或高脂饮食诱导NLRP3 炎性体激活和IL-1β 分泌，可促进骨髓细胞表观遗传重编程和包括粒细胞/巨噬细胞祖细胞在内的造血干细胞大量扩增，从而驱动训练免疫［24］。因此，抑制NLRP3炎性体或IL-1β 及其诱导的训练免疫，可能是治疗AS 或减轻其影响的一个有吸引力的靶点［1，24，35］。与 IL-1β 相比，IL-1α在促进固有免疫与增加细胞代谢压力方面具有更重要的作用，易于诱导AS 无菌性炎症，提示IL-1α作为AS的治疗靶点值得进一步研究［22，36-37］。

3 AS的训练免疫机制

3.1 表观遗传调控 表观遗传调控是指独立于DNA 序列基因转录的调控，发生在DNA 和组蛋白修饰水平，也可以涉及RNA 的调节［31］。表观遗传变化控制组织和DNA 编码信息的特定表达，它们共同设置“组蛋白代码”，以控制选定转录因子的相互作用和功能［38］。在染色质结构水平上的表观遗传重编程作为训练免疫的核心机制，参与AS 形成过程中的重要环节。

3.1.1 单核/巨噬细胞中表观遗传的变化 表观遗传机制可以调控单核细胞向巨噬细胞分化、极化和活化过程，也可以控制单核细胞和巨噬细胞对全身和局部炎症刺激（如脂质、细胞因子、DAMPs等）的直接反应［31，39-40］。全表观基因组分析显示，体外单核细胞向巨噬细胞分化过程中5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）丢失［41］。尽管 DNA 甲基化与基因组调控有密切联系，但人们对DNA 甲基化在固有免疫记忆中的潜在作用知之甚少。最近报道miRNA 和lncRNA 在建立和维持训练免疫表观遗传修饰方面也具有重要作用［42-44］。然而，目前研究最为深入的是组蛋白修饰对训练免疫的影响。

组蛋白乙酰化中和赖氨酸残基的正电荷，刺激转录因子的结合，从而激活基因转录［4，6］。研究发现在促AS 溶血磷脂酰胆碱激活的人主动脉内皮细胞中编码训练免疫酶的基因组区域，组蛋白H3第14位赖氨酸乙酰化（H3K14ac）水平升高［45］。与组蛋白乙酰化相比，组蛋白甲基化对基因转录或抑制的作用更为复杂，且具有特异性［4，6］。组蛋白甲基化水平的表观遗传重编程对于ox-LDL 体外诱导人单核细胞的训练免疫是至关重要的，其特征是促炎细胞因子和趋化因子的启动子上富集的组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化（H3K4me3），逆转组蛋白的甲基化使ox-LDL 诱导的训练免疫表型完全消失［1，31］。此外，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）可以诱导训练免疫，随后在脂多糖刺激下，增加TNF-α 生成，这个过程依赖于丝裂原激活蛋白激酶、ERK1 和 ERK2［1，46］。针对GM-CSF 的抗体可能发挥抑制训练免疫的作用［1，47］。

3.1.2 表观遗传酶的影响 组蛋白修饰是可逆的，因此可以通过药理学靶向调节表观遗传酶的活性，起到相应治疗目的［40］。组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylases，HDACs）调节染色质的乙酰化状态，在巨噬细胞促炎和抗炎表型的转化过程中发挥不同的功能。HDAC3 是AS 中巨噬细胞表型的主要调节因子，小鼠骨髓特异性删除HDAC3 使巨噬细胞获得抗炎和促纤维化特征，稳定AS 斑块［48］。且在这些巨噬细胞中，IL-4 和转化生长因子β 信号通路受到抑制［48-49］。HDAC3 促进巨噬细胞向 M1 表型极化，缺乏HDAC3则诱导巨噬细胞M2型极化［9，38］。 此 外 ，HDAC9 也与增加载脂蛋白E 敲除（apolipoprotein E knockout，ApoE-/-）小鼠 AS 病变大小相关［50］。在LDLR-/-小鼠模型中，全身和骨髓缺失HDAC9 与限制AS有关。巨噬细胞缺失HDAC9减少促炎基因表达，增加ABCA1、ABCG1 和过氧化物酶体增殖激活受体γ 等活性转运蛋白表达，增强胆固醇外排，减少泡沫细胞形成［51］。相比之下，HDAC4 可以在小鼠 DC 分化过程中，诱导IL-4 信号通路中精氨酸酶1 表达，从而起到抗炎性极化的作用［52］。综上所述，这些发现表明药物靶向或细胞特异性干预HDACs 可以抑制AS炎症反应。

调控组蛋白甲基化的表观遗传酶对于巨噬细胞炎症也具有重要影响。研究发现阻断特定的H3K27组蛋白去甲基化酶——含Jumonji 结构域蛋白3（Jumonji domain-containing protein 3，JMJD3），可以抑制巨噬细胞的激活以及炎症细胞因子产生［53］。组蛋白甲基转移酶抑制剂5'-脱氧-5'-甲基硫代腺苷（5'-deoxy-5'-methylthioadenosine，MTA）预处理单核细胞可使 ox-LDL 衍生的细胞重编程失效［9］。TNF-α 诱导核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）基因表达，需要混合谱系白血病蛋白1（mixed-lineage leukaemia protein 1，MLL1；具有组蛋白甲基转移酶活性）向组蛋白H3K4 中添加甲基基团［54］。组蛋白甲基转移酶——含 SET 和 MYND 结构域蛋白 5（SET and MYND domain-containing protein 5，SMYD5）在 NF-κB 靶基因中维持抑制标记H4K20me3，受到刺激时这些抑制机制被消除，进而诱导启动子和增强子中激活表观遗传标记的积累［55-56］。总之，组蛋白甲基转移酶可以调控巨噬细胞炎症，其在训练免疫中的作用值得进一步研究。

此外，10-11 易位（ten-eleven translocation，TET）甲基胞嘧啶双加氧酶作为关键的DNA 去甲基化酶，也可通过与核染色质修饰酶相互作用，促进组蛋白的修饰［44］。例如，TET2 招募 HDAC2，通过组蛋白去乙酰化，抑制促炎基因IL-6转录［57］。巨噬细胞内TET2缺失，使IL-1β基因启动子组蛋白 H3 乙酰化增加［58］。最近多项证据表明TET2 具有抗AS 和保护血管作用［4，35］。其中，TET2 不仅在血管平滑肌细胞和内皮细胞中发挥作用，而且影响单核/巨噬细胞分化、极化、表达炎症基因等多个方面［4］。值得注意的是，Fuster 等［58］发现在LDLR-/-小鼠模型中TET2基因缺失，导致巨噬细胞中NLRP3 炎性体介导的IL-1β分泌增多。TET2突变促进造血干细胞和干细胞衍生单核细胞的增殖，且AS 斑块面积显著增加［58-60］。因此探索造血细胞克隆是否会诱导训练免疫非常有意义［6］。

3.2 免疫代谢的调控 细胞内代谢改变引起表观遗传重编程，可诱导训练免疫表型，促进炎症反应。斑块微环境中DAMPs、修饰的脂蛋白、缺氧等因素驱动单核/巨噬细胞的代谢和功能重组。细胞内糖酵解的激活、戊糖磷酸途径、脂肪酸合成、脂肪酸氧化的减少伴随着脂质溶酶体处理的复杂变化，似乎都有助于AS 的发生，这些过程也推动了训练免疫的发展［61］。利用巨噬细胞代谢的可塑性平衡炎症反应，恢复AS中保护性免疫功能，是目前研究的热点［23］。

巨噬细胞中葡萄糖、胆固醇、脂肪酸和氨基酸代谢重编程在AS 过程中促进炎症反应［62］。研究发现葡萄糖代谢和氧化反应不仅满足巨噬细胞活化所需能量，而且与细胞免疫代谢反应有关。葡萄糖代谢从氧化磷酸化转变为有氧糖酵解、谷氨酰胺代谢增加、胆固醇合成等过程在免疫信号诱导的细胞代谢重组中起着至关重要的作用［63］。不同的代谢途径满足不同巨噬细胞表型的能量代谢需求。M1 型巨噬细胞很大程度上依赖糖酵解，其特征是线粒体氧化磷酸化受损以及TCA 循环的合成代谢再利用［63-64］。此外，丙酮酸通过缺氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF1）依赖的途径发酵成乳酸，而不是进入TCA 循环，最终为氧化磷酸化提供能量［64］。M2 型巨噬细胞依赖于氧化磷酸化进行代谢，且增加脂肪酸摄取，促进β 氧化［63］。两种不同的亚型显示出氨基酸代谢和脂肪酸合成与利用的差异［64］。

训练免疫过程中伴随细胞内代谢通路的深度重组，包括糖酵解、氧化磷酸化、谷氨酰胺分解和胆固醇合成。例如，β-葡聚糖刺激单核细胞后，激活组蛋白H3K3me3 和H3K27ac 修饰在几个关键糖酵解酶的启动子上富集［61］。训练的巨噬细胞代谢重组导致琥珀酸和富马酸显著升高［64］。富马酸盐刺激可形成一种类似于β-葡聚糖诱导的训练免疫的表观遗传程序。由于谷氨酰胺补充的TCA 循环，富马酸的积累整合免疫和代谢回路，通过抑制赖氨酸特异性去甲基化酶5（lysine-specific demethylase 5，KDM5）诱导单核细胞表观遗传重编程［61-62］。总之，训练后的单核细胞和巨噬细胞的代谢变化是训练免疫表型的重要组成部分，且代谢和表观遗传变化之间具有紧密联系［3］。代谢物浓度的波动调节表观遗传基因组，干预染色质动力学，从而影响基因的持续表达。许多研究发现，消耗表观遗传反应中代谢产物的酶，可以整合代谢信息和控制转录［64］。

在训练免疫的单核细胞中另一个重要的代谢事件是TCA 循环的合成代谢再利用，从柠檬酸盐和乙酰辅酶A 合成胆固醇和磷脂，甲羟戊酸的合成在这一过程中起着核心作用［1］。激活胆固醇合成途径，而不是胆固醇本身，对骨髓细胞的训练免疫必不可少［65］。甲羟戊酸盐作为胆固醇生物合成途径的第一个代谢产物，它在细胞内的积累，可以通过激活胰岛素样生长因子1 受体（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）和 mTOR 诱导单核细胞训练免疫［4，29，65］。他汀类药物阻断甲羟戊酸生成能够阻止训练免疫表型，此外，用雷帕霉素抑制mTOR 和用MTA 抑制组蛋白甲基化，也可防止甲羟戊酸诱导的训练免疫，表明训练免疫中代谢和表观遗传控制之间存在微妙平衡［1，4］。胆固醇生物合成和（或）甲羟戊酸，是成熟髓系细胞或造血祖细胞先天性免疫训练的重要调停者。在训练免疫期间，胆固醇依赖性免疫代谢串扰也可能与血脂异常或高胆固醇血症相关的造血功能变化密切相关，后者可导致AS 过程中骨髓生成增强［59］。进一步明确胆固醇合成对于训练免疫的影响，对于了解代谢重组在AS 中的作用具有一定意义。

4 结语与展望

训练免疫是先天宿主防御机制的重要特征，提示固有免疫细胞存在免疫记忆，表观遗传和代谢重编程是其中的核心机制。在AS过程中，单核/巨噬细胞受到ox-LDL 刺激可通过细胞代谢和表观遗传重组，诱导长期的促炎表型，加速疾病进程，说明AS 作为一种慢性炎症性疾病与训练免疫关系密切，靶向干预训练免疫相关机制可能是恢复AS 免疫稳态的可行策略。例如:（1）探索训练免疫过程中单核/巨噬细胞分化所涉及的相关机制，并进行药理学干预；（2）针对单核/巨噬细胞接受刺激后表观遗传变化相关机制进行靶向干预，包括改变表观遗传酶的活性调节组蛋白及DNA 修饰、或通过改变非编码RNA 水平调整相关基因表达；（3）调整单核/巨噬细胞训练免疫过程中细胞的代谢情况，如糖酵解、氧化磷酸化、谷氨酰胺分解、胆固醇合成等；（4）靶向干预ox-LDL或高脂饮食刺激诱导单核/巨噬细胞表观遗传和代谢改变涉及的分子通路；（5）抑制NLRP3炎性体活化及IL-1β 生成；（6）寻找AS 过程中新的训练免疫细胞亚群及抗原刺激物，开发针对不同亚群或刺激物的治疗方法。最后需要明确的是，虽然干预训练免疫为AS 在内的免疫相关疾病提供了新的诊疗策略，但同时需注意监测机体感染风险。