青蒿素及其衍生物对肿瘤干细胞的作用研究进展

许藏藏，肖林凡，温 顺，牟玲丽

(湖南师范大学 医学院小分子靶向药物研究与创制湖南省重点实验室，湖南 长沙 410013)

肿瘤是严重威胁人类健康的一大顽疾，患者经过治疗，仍旧容易复发并且产生药物抵抗。研究表明，引起肿瘤复发、转移和化疗抵抗与人体组织中的一小群干细胞密切相关，这部分干细胞被叫做肿瘤干细胞(CSCs)[1]。CSCs具有独特的自我更新、增殖和分化能力，在不同类型的恶性肿瘤中，CSCs对肿瘤的进展、耐药性、复发和转移均有显著影响[2-4]。因此，抑制肿瘤干细胞活性成为了一个有前途的肿瘤干预策略。

青蒿素是从菊科植物黄花蒿中提取出的具有抗疟作用的生物活性物质。研究发现，除抗疟活性外，青蒿素及其衍生物双氢青蒿素、青蒿琥酯等还具有抗肿瘤、免疫抑制、抗病毒等活性[5]，其抗肿瘤活性抗瘤谱广、选择性高、毒副作用小和无交叉耐药现象等特点引起了研究学者的广泛关注[6]。目前，研究发现此类化合物的抗肿瘤作用机制涉及广泛，包括诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制血管生长[7]、诱导自噬和铁死亡[8]以及铁激活产生碳自由基杀伤肿瘤细胞[9]等，并且研究学者也发现此类化合物可以抑制肿瘤干细胞的活性，有望被发展成肿瘤干细胞抑制剂治疗肿瘤。因此，本文就青蒿素及其衍生物在对肿瘤干细胞标记物、侵袭迁移、凋亡、线粒体代谢及DNA基因重组方面的影响及涉及到的作用机制做一综述。

1 青蒿素及其衍生物下调肿瘤干细胞标记物的表达

1.1 Nanog、Sox2和Oct3/4

Nanog蛋白由Nanog Ⅰ基因编码，305个氨基酸组成，包含与DNA结合的保守同源域。研究表明，Nanog蛋白家族对CSCs的重要性表现在3个方面：1)在许多癌症类型中，Nanog蛋白表达增加；2)Nanog蛋白增加与肿瘤干细胞样表型密切相关；3)下调或者敲除Nanog蛋白能够减少肿瘤恶化[10]。转录因子Sox2是Sry相关的HMG盒(Sry-related high mobility group Box)家族成员，作为肿瘤干细胞标志物，具有调控胚胎干细胞自我更新、维持干细胞特性和建立诱导性多能干细胞等重要作用[11]。转录因子Oct3/4是POU转录因子家族中的一员，主要作用是调控胚胎干细胞的生长和分化，它也是干细胞全能/多能性状态与分化状态转变的重要指标[12, 13]。在肺癌细胞中，Sox2、Oct3/4和Nanog共同调节肺癌干细胞的自我更新能力[14]。研究表明[15]，青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯对肺癌A549细胞的干细胞标记物Nanog、Sox2和Oct3/4蛋白的表达水平具有抑制作用。在体外，青蒿素的抑制作用最强，在30 μM的剂量下，Nanog和Sox2蛋白表达量可以减少65%和80%。在体内，青蒿琥酯的抑制作用最强，Oct3/4、Sox2和Nanog的表达水平分别减少了5.1%、19.3%和7.92%。

1.2 乙醛脱氢酶(Acetaldehyole dehydrogenase,ALDH)

ALDH作为实体瘤干细胞的标志物，是一类参与重要的细胞代谢过程乙醛的解毒和维甲酸合成的酶家族，在肿瘤干细胞自我更新和分化中起重要作用[16]。Zheng等[17]研究发现青蒿琥酯可以减少葡萄膜黑色素瘤细胞的ALDH+亚群，并且可以抑制葡萄膜黑色素瘤球的再形成，揭示青蒿琥酯可以减少葡萄膜黑素瘤细胞中的肿瘤干细胞。其涉及的作用机制是抑制Wnt/β-catenin信号通路。Wnt/β-catenin信号通路是调控肿瘤干细胞的3条主要的信号通路之一，其对于干细胞的维持以及抑制细胞的分化不可或缺[18]，β-catenin的稳定是Wnt/β-catenin信号通路的核心，当β-catenin水平低下时，Wnt通路处于关闭状态，反之，处于开启状态。青蒿琥酯可以降低β-catenin和它的下游靶点c-Myc和cyclin D1的蛋白表达水平[17]，进而使肿瘤干细胞的活性受到影响。

2 青蒿素及其衍生物抑制肿瘤干细胞侵袭迁移

CSCs在多种肿瘤的侵袭和转移中发挥着关键的作用。王唯一等[19]发现双氢青蒿素可以抑制喉癌干细胞的侵袭迁移能力，并在体外体内实验中发现双氢青蒿素发挥此作用是通过IL-6/STAT3信号通路，其可以抑制STAT3的磷酸化从而使得其下游的侵袭和转移相关蛋白基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达下降，丢失粘附蛋白E-cadherin表达上调，进而达到抑制肿瘤侵袭、转移的目的。吴艳林等[20]发现双氢青蒿素可使胶质瘤干细胞侵袭迁移能力减弱。他们通过qRT-PCR技术检测了经不同浓度双氢青蒿素处理过的胶质瘤干细胞中的Toll样受体2、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9的mRNA表达水平，发现其表达水平均降低，并且呈剂量依赖性。该结果提示双氢青蒿素抑制小鼠胶质瘤干细胞的侵袭和迁移与Toll样受体信号通路有关。

3 青蒿素及其衍生物诱导肿瘤干细胞凋亡

胶质瘤干细胞被考虑为治疗胶质瘤的一个潜在靶点，其与胶质瘤的复发、转移和高死亡率密切相关。已有研究报道双氢青蒿素在体外可通过触发ROS产生和抑制谷胱甘肽硫转移酶增强胶质瘤细胞的放射敏感性[21]，而对于胶质瘤干细胞的影响则主要集中在对胶质瘤干细胞的凋亡影响上。如Cao等[22]发现双氢青蒿素可以通过抑制AKT的磷酸化和激活Caspase-3从而抑制胶质瘤干细胞增殖，诱导剂量依赖性的细胞周期G1期阻滞和诱导胶质瘤干细胞凋亡。Li等[23]报道多功能脂质体包载的紫杉醇和蒿甲醚对胶质瘤细胞或胶质瘤干细胞有细胞毒效力，并且可以诱导胶质瘤细胞或胶质瘤干细胞凋亡，这与其可以明显激活胶质瘤细胞凋亡蛋白Caspase-9、Caspase-3和Bax的活性，减弱抗凋亡蛋白Bcl-2的活性密切相关。

4 青蒿素及其衍生物扰乱肿瘤干细胞的线粒体代谢功能

CSCs能量代谢是肿瘤治疗的一个潜在靶点。CSCs依赖于糖酵解和氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation, OXPHOS)代谢过程，并且表现出代谢可塑性和高度灵活性，以适应不同的微环境。比如糖酵解可使CSCs在无氧或者营养饥饿的条件下生存。与糖酵解代谢相关的葡萄糖吸收、糖酵解酶的表达、乳酸的产生和ATP水平在CSCs中也显著升高[24, 25]。有研究学者用二氯乙酸酯改变CSCs线粒体代谢来预防或治疗肿瘤。二氯乙酸酯能够抑制丙酮酸脱氢酶激酶(Pyruvate dehydrogenace kinase,PDK)磷酸化丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenese,PDH)，并促进丙酮酸转化为乙酰辅酶A，使线粒体代谢从糖酵解向OXPHOS转变，从而减少细胞增殖，促进细胞凋亡及抑制肿瘤生长[26]。由此得知，抑制糖酵解和促进氧化磷酸化均会对CSCs产生抑制作用。

Subedi等[27]利用高通量筛选的方法筛选了大约6000个化合物，发现青蒿素类似物NPD2604、青蒿素和青蒿琥酯对肿瘤球有很好的选择性。选择安全性高的青蒿琥酯作为CSCs抑制剂进行研究发现，指示线粒体氧化磷酸化的耗氧率(Oxygen consumption rate,OCR)在肿瘤球的3D细胞中略有升高而指示糖酵解的细胞外酸化速率(Extracellular acidification rate, ECAR)大幅降低，表明青蒿琥酯诱导线粒体功能紊乱，从而抑制肿瘤干细胞的肿瘤球形成能力。

5 青蒿素及其衍生物抑制肿瘤干细胞的DNA同源重组和复制衰老

重组蛋白RAD51是通过同源重组来修复DNA双链断裂的核心因子。有效下调肿瘤组织中的RAD51的水平，可降低肿瘤细胞的DNA损伤修复能力，从而提高肿瘤治疗的疗效。通常情况下，肿瘤干细胞会高表达RAD51蛋白，从而比非干细胞更有效地修复DNA损伤[28-30]。Berte等[31]研究发现青蒿琥酯可以增强化疗药替莫唑胺抑制胶质瘤细胞及胶质瘤样干细胞的活性，主要是通过下调RAD51蛋白表达和抑制DNA同源重组活性而发挥此作用。化疗药替莫唑胺诱导复制衰老，其会减少细胞凋亡和坏死，进一步的研究发现青蒿琥酯能够减少替莫唑胺诱导的胶质瘤干样细胞的复制衰老。

6 结论

综上所述，青蒿素及其衍生物对肿瘤干细胞的影响已经取得了一定的进展，也为天然产物作为肿瘤干细胞抑制剂提供了实验依据。但是相比对肿瘤细胞的影响，此部分工作仍存在一些不足之处：1)涉及的肿瘤干细胞类型过少，只有肺癌干细胞、胶质瘤干细胞、喉癌干细胞等，对其他类型肿瘤干细胞的影响还需要进一步探讨；2)此类化合物对肿瘤干细胞影响的相关作用机制需要进一步深入研究，调控肿瘤干细胞的主要信号通路有3条：Wnt/β-catenin信号通路、Notch信号通路和Hedgehog信号通路，青蒿素类化合物对肿瘤干细胞调控信号通路的影响目前还只研究了Wnt/β-catenin信号通路，其他两条信号通路仍需做进一步研究。另外，此类化合物发挥抗肿瘤活性需要依靠铁离子的激活从而产生碳自由基来发挥作用，据此，在对肿瘤干细胞进行研究时，也可以铁离子及富含铁离子的血红素作为切入点进行深入研究。