蓝舌病病毒蛋白结构与检测方法研究进展

史卫军 ， 黄超华 ， 曹琛福 ， 林彦星 ， 王 潇 ， 花群义

(1.深圳海关动植物检验检疫技术中心 ， 广东 深圳 518045 ； 2.华南农业大学兽医学院 ， 广东 广州 510642)

蓝舌病(Bluetongue, BT)是由蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)引起，经库蠓、伊蚊等媒介昆虫传播感染反刍动物的烈性非接触性传染病。1876年首次在南非被发现[1],1906年Theiler正式命名为“蓝舌病”，将引起该病的病毒命名为蓝舌病病毒[2]。20世纪初，伴随国际贸易的发展，BT随后传入美洲、亚洲、欧洲等地，中国1979年首次发现该病的存在。BTV主要引起绵羊发病和死亡，牛和山羊常为隐性感染，反刍动物感染后平均死亡率为35%，易感绵羊死亡率可高达80%[3-4]。蓝舌病的分布与中间宿主的活动范围有很大关系，大致分布在北纬40°和南纬45°区域之间，一些地区在北纬50°内也检测到BTV，这种分布情况的改变可能与全球气候变暖有关。蓝舌病因分布范围广、危害大，被世界动物卫生组织(OIE)列为须法定报告的动物疫病，中国将其列为一类动物疫病[5]，也是我国出入境口岸重点检疫的外来动物疾病。本文简述了蓝舌病病毒蛋白结构及诊断方法，旨在为进一步研究病毒和新的检测方法提供参考。

1 病毒结构

BTV是呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)蓝舌病病毒亚群(Bluetonguevirussub-group)的成员。完整的BTV粒子为圆形、无囊膜的二十面立体对称结构，核衣壳直径为53～60 nm，加上衣壳外细绒毛状层，总直径为70～80 nm，是目前分子质量最大的RNA病毒[6]。迄今为止，全世界范围内共分离到27种不同血清型的BTV[7]，不同的血清型之间无交叉保护作用[8]。有研究表明，相继在中东和南非检测到28型和29型BTV[9]。我国引起蓝舌病的主要病原为1型和16型。

BTV由10个大小不等的双链RNA基因片段组成，其分段基因组RNA3′和5′端各含有特异的重复保守序列，为5′-GUUAAA 和3′-ACUUAC[10]。10个独立的RNA片段分别命名为L1～3、M4～6、S7～10，可编码7种结构蛋白(VP1～7)和4种非结构蛋白(NS1～4)。除S10节段外每个节段只编码一种蛋白[11]。BTV具有双层衣壳结构，最外层由VP2(111 kDa)和VP5(59 kDa)构成，核心衣壳由VP3(100 kDa)和VP7(38 kDa)2种主要结构蛋白和VP1(149 kDa)、VP4(76 kDa)、VP6(36 kDa)3种次要结构蛋白构成。4种非结构蛋白可能参与了BTV的复制、“裁剪”和运输，是在被BTV感染的细胞中合成的[12]。

2 病毒蛋白

2.1 外衣壳蛋白VP2、VP5 VP2和VP5构成包裹BTV核心颗粒的外层衣壳，约占BTV总蛋白量的40%。外壳蛋白在病毒吸附靶细胞和进入细胞过程中发挥关键性作用，研究发现，除去VP2或VP2及VP5后的BTV核心颗粒对哺乳动物细胞不具有感染能力，但对昆虫细胞更具感染性。

VP2由L2基因编码，位于病毒粒子的最外层，是病毒的主要型特异性抗原和血凝素蛋白，BTV的血清型特异性抗原决定簇主要存在于VP2中。VP2由950～960个氨基酸组成，不同血清型之间氨基酸序列变化范围为22.7%～72.9%，各血清型缺乏有效交叉免疫保护。相同血清型不同地域不同毒株的VP2蛋白的核苷酸序列，最大的差异可以达到30%。VP2蛋白能与宿主细胞表面的血型糖蛋白A结合，参与病毒的吸附和进入，缺失VP2的病毒不能结合细胞，也不具有感染细胞的能力。VP2可以诱导产生中和抗体，并对同一血清型病毒产生免疫保护。

VP5由M5基因编码，以三聚体形式整齐分布在病毒粒子表面，大小为526个氨基酸。VP5也是型特异性抗原，但更加保守，不同血清型BTV间同源性为70%以上，产生的中和抗体具有群特异性，在一定程度上可以反映病毒的地域来源。VP5与病毒的毒力有关，调节病毒粒子从内吞泡释放到细胞质，增强细胞膜透性化。VP5在VP2免疫中和反应中起增强作用，对研究BT疫苗具有重要意义。

2.2 内衣壳蛋白VP3和VP7 VP3和VP7是BTV核衣壳的2种主要蛋白，与3种次要蛋白共同组成包裹基因组的内层衣壳，保持着BTV核心结构的完整性。

VP3由L3基因编码，位于病毒衣壳最内层，有903个氨基酸残基，高度保守，属群特异性抗原。VP3蛋白分为A和B两种构型，2种构型形成闭合的亚核芯层结构，为VP7三聚体的附着提供了支架。亚核芯层同时与内部的VP1、VP4、VP6及dsRNA紧密结合，在维持病毒核芯颗粒结构的完整性起重要作用。研究发现，VP3与BTV的毒力无关。

VP7由S7基因码编，以三聚体的形式存在于VP3蛋白表面，大小为349个氨酸基，至少有2个表位暴露，是BTV主要的血清群特异性抗原，在病毒的复制和传播中起重要作用。位于VP7蛋白255处的赖氨酸残基对病毒内衣壳的形成起着必不可少的关键作用[13]。VP7在不同血清型中具有高度保守性和较强的抗原性，26种不同血清型中其氨基酸残基的同源性达到98%。细胞被BTV感染后，VP7是最早被检测出的抗原，动物被感染后，VP7抗体也是机体产生的主要抗体之一，所以VP7是建立BTV群特异性血清学检测方法的最佳抗原[14]。在缺乏VP2或VP5的情况下，VP7也可介导BTV对昆虫细胞吸附和侵入。

2.3 核芯蛋白VP1、VP4、VP6 VP1、VP4、VP6三种核芯蛋白与内衣壳蛋白和10条基因组共同组成BTV核心颗粒。3种核芯蛋白具有酶活性，参与转录及加帽装饰等过程。

VP1由L1基因编码，长1 302个氨酸基，是BTV蛋白质中最大的蛋白，分子重量为149.5 kDa，但在病毒粒子中占的比列很少，每个病毒粒子中大约只有12个拷贝。VP1具有RNA聚合酶活性，并对Mg2+具有依赖性，可以寡聚核苷酸A为引物延伸RNA的合成，并能作为BTV复制酶以正链RNA为模板合成双链RNA。在27～37 ℃之间VP1的活性最大，能在昆虫细胞和哺乳动物中进行有效的复制。

VP4由M4基因编码，长654个氨基酸，主要作为鸟苷酸转移酶参与病毒mRNA的合成。早期的蓝舌病病毒mRNA并不具有生物活性，需要加帽修饰才能使mRNA更稳定和高效翻译，参加这一装饰过程的4种酶都需要VP4蛋白进行催化。另外，VP4细长的模块化晶体结构也为病毒粒子的有效装配提供了支架[15]。

VP6由S9基因编码，长328个基氨酸。VP6免疫原性很强，但较保守，被认为是一种群特异性抗原，可以诱导高滴度的特异性抗体产生。VP6还具有ATP结合活性，能展开BTV的双链并辅助mRNA的合成。

2.4 非结构蛋白NS1、NS2、NS3、NS3A 和NS4 目前，在BTV感染的细胞中已经检测到4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a、NS4)。4种非结构蛋白在不同血清型BTV之间保守性很强，它们在病毒粒子的组装和运输过程中起重要作用。研究发现，非结构蛋白在区分受BTV感染动物和接种疫苗动物鉴别诊断方面也具有很大潜力。

NS1由M6基因编码，含有552个氨基酸，分子量64 kDa，是BTV最大的一个非结构蛋白,也是蓝舌病病毒编码的蛋白中表达量最高的。NS1在不同血清型的BTV之间高度保守，基因相似性达80%～90%，为一种型特异性抗原。电子显微镜下观察被BTV感染的细胞，可以看到大量的病毒特异性小管(直径52.3 nm，长1 000 nm)组成的多聚体NS1蛋白。有试验证实，这些小管可以选择性促进BTV单链RNA的翻译，增加病毒滴度[16]。研究发现，NS1的表达量可能会决定病毒的释放方式，影响到病毒对细胞的损伤程度。

NS2由S8基因编码，含有357个氨基酸，蛋白分子大小约为42 kDa。主要存在于被感染细胞的细胞核附近，聚集病毒基因组复制及核心组装所需的病毒单链RNA和蛋白成分，形成病毒包涵体(VIBs)。NS2是BTV感染细胞中唯一确定的磷蛋白，具有良好的抗原性，可以与单链RNA结合，并可以使三磷酸核苷酸水解成单磷酸核苷酸。这表明NS2蛋白在病毒复制过程中起重要作用。

NS3由BTV基因组中长度最小的S10基因编码，S10基因有2个开放阅读框，分别编码具有229个氨基酸的NS3(25.5 kDa)和216个氨基酸的NS3a(24 kDa)。NS3a与NS3相比，缺少了N端的13个氨基酸，两者氨基酸序列及核苷酸序列都具有高度保守性，高达82%～99%，具有群抗原特异性。NS3在BTV复制和形成过程中在宿主细胞中产生，先集聚在细胞高尔基体上，后转移到宿主细胞膜上以糖基化的膜蛋白存在。NS3/NS3A蛋白在哺乳动物细胞中的表达量相对较少，仅可以勉强检测出来，但在昆虫细胞中具有很高的表达量，因此这2种蛋白可能的主要作用是参与了BTV在昆虫体内的传播。NS3是BTV编码的唯一膜蛋白，二级结构具有2个跨膜螺旋，其氨基酸序列的118～148位点和156～181位点形成螺旋结构跨越整个细胞膜。研究发现，NS3与VP2相互作用，通过招募ESCRT-I蛋白Tsg101来帮助病毒从感染细胞中释放[17]。

NS4是2011年发现的一种新型非结构蛋白，位于BTVS9基因上，与VP6的ORF相重叠，含有77～ 79个氨基酸残基，分子量10 kDa，高度保守，NS4的N端富含碱性氨基酸，C端有亮氨酸拉链结构[18]。试验证实，其在病毒感染早期表达，是复制非必需蛋白，具有非典型核定位信号，在干扰素应答适应性和小鼠致病性中扮演着重要角色[19]。

3 检测方法

3.1 病原学检测 病毒分离鉴定是世界动物卫生组织(OIE)推荐的蓝舌病诊断方法之一。BTV可在10～11日龄鸡胚、易感细胞(如蚊子细胞C6/36、仓鼠肾细胞BHK-21、非洲绿猴肾细胞Vero等)和绵羊身上增殖。鸡胚接种与细胞培养相结合是目前分离BTV最敏感和有效的方法。我国BTV分离鉴定的方法主要依据《蓝舌病诊断技术》(GB/T18636-2017)和《蓝舌病病毒分离、鉴定及血清中和抗体检测技术》(GB/T18089-2008)进行，基本步骤为：病料采集及制备(全血、肝、脾、肾、淋巴结、精液、库蚊)-鸡胚静脉接种-接种C6/36细胞-BHK21或Vero细胞盲传3代以上-鉴定、定型。

3.2 血清学检测

3.2.1 琼脂糖免疫扩散试验(AGID) AGID为最早推广应用的抗体检测方法之一，也是OIE推荐使用的方法。1962年，Klontz最先应用AGID检测蓝舌病病毒群特异性抗体，我国目前仍在使用该方法诊断蓝舌病。琼脂扩散试验用从BTV在BHK-21或Vero细胞培养物提取的可溶性抗原，与待检血清在琼脂糖凝胶中进行免疫沉淀反应，同时设阴、阳性血清对照,室温放置24 h后，有沉淀线出现的为蓝舌病病毒抗体阳性。该法简便易行，可以在没有复杂实验设备条件下对大量血清样品进行低成本检验。缺点是灵敏性和特异性稍差，与环状病毒及其他病毒如流行性出血病病毒(EHDV)等存在交叉反应，容易受到抗原的水溶解性、决定簇数量和分子量、抗原和抗体的比例、pH 值等不同条件的影响[20]。

3.2.2 血清中和试验(MTSN) 主要方法为将56 ℃灭活后的待检血清倍比稀释后与不同血清型BTV在37 ℃，5%CO2培养箱进行孵育，同时设平行组和对照组，72～168 h后通过观察细胞病变效应(CPE)情况来判定结果，当被检血清孔50%出现保护的，判定为阳性，该孔此时的血清稀释度即为该份血清的中和抗体滴度。有人对自然感染动物和人工接种动物进行了血清效价监测，发现自然感染康复绵羊的中和抗体滴度可达1∶160以上，远高于人工接种绵羊。MTSN的特异性和敏感性较强，可用于BTV型特异性抗体的检测及分离。不足是准确性和测定效价会受细胞培养条件、培养液成分及细胞类型等因素影响。

3.2.3 过氧化物酶染色法(IPS) 该方法是利用标记抗体来检测蛋白抗原，包括间接过氧化物酶检测法(IP)、荧光抗体检测法(FA)及过氧化物抗过氧化物酶检测法(PAP)等3种方法。其中敏感性最高的是IP中以抗生物素及生物素的复合物标记过氧化物酶为基础的ABC- IP检测方法，已在生产实践中得到应用。IPS缺点是制备抗原蛋白和相应单克隆抗体操作繁琐，无法长期保存原材料。

3.2.4 酶联免疫吸附试验(ELISA) ELISA是最常用的血清学检测方法。20世纪80年代，国外已先后报道了BTV间接ELISA、阻断ELISA、竞争性ELISA检测方法的建立。竞争性ELISA方法为OIE推荐的BTV血清学诊断方法，也是检测BTV最敏感的检测方法，该方法主要使用抗NS1蛋白单抗和抗VP7蛋白单抗，可用来检测任何感染动物体内的蓝舌病抗体，且与其他环状病毒不会出现交叉反应。近年来，国内外学者以VP5、VP2、VP3、VP7、NS1、NS3等特异性抗原及基因表达抗原建立了不同的ELISA检测方法，特异性和灵敏性都较高。ELISA方法具有特异性高、操作简便、耗时少、结果便于观察等优点，所以目前被广泛研究和应用。

3.3 分子生物学检测

3.3.1 聚合酶链式反应检测技术(PCR) PCR是一种快速的体外DNA片段扩增技术，在BTV的血清型分类、核酸研究及病毒检测上得到了广泛应用。PCR技术以蓝舌病病毒mRNA为模板反转录获得cDNA，再以此为模板进行PCR扩增得到BTV片段，经过限制性酶切后电泳进行分析。目前采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和序列分析是用来进行BTV检测和鉴定非常有效的分子诊断技术，该方法具有灵敏度高、特异性强、产率高、重复性好等特点，适用于感染早期病毒量少时的临床检测。采用巢式RT-PCR检测血液和组织中的BTV已被OIE推荐为国际贸易采用方法，具有特异、快速、灵敏等优点。实时荧光定量PCR技术(FQ-PCR)利用荧光信号累积实时监测扩增产物的量，在一定程度上实现了定量检测的目的，其灵敏度及特异性高，操作简便快捷，缺点是易被扩增抑制物抑制和出现假阳性。

3.3.2 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交技术是利用不同来源的DNA单链与RNA链彼此有互补的碱基序列而结合来检测相应的病原核酸。在BTV核苷酸序列的检测中，设计BTV cDNA探针，通常分子探针制备选取cDNA片段L2、L3、S7、M6，利用其与BTV病毒RNA进行核酸杂交以检测BTV抗原。尽管核酸分子杂交法具有敏感性强、特异性高、耗时短等特点，但过程十分繁琐，而且对实验条件、实验技能要求也相对较高，并不适用于常规的病原检测。

4 小结

蓝舌病病毒是结构最复杂的RNA病毒之一，由多种病毒蛋白和多节段的RNA基因组构成，有27种血清型，不同的血清型之间无交叉保护作用。近年来受全球气候变暖及国际贸易的影响，蓝舌病在全球呈现出扩大的流行趋势，病毒部分血清型的遗传特性也在发生改变，导致病毒毒力改变、致病力增强，不仅造成了严重的经济损失，也给研究和防治工作带来了较大的挑战性。快而准的检测是控制和消灭蓝舌病的基础，尽管现在已经建立了许多BTV的检测和鉴定方法，但仍存在检测成本高、步骤繁琐、周期长、结果不稳定、识别抗原单一等问题，需要通过研究进行完善和优化。因此，了解蓝舌病病毒结构功能及检测现状，对于进一步探索新的检测方法和疫病防制都具有重要意义。